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目的:通过对复方鳖甲软肝片处方中紫河车剔除或替代的药效学研究,以及单味羊胎盘与紫河车免疫调节功能的一致性评价,以期解决由紫河车资源短缺及使用受限所造成的复方鳖甲软肝片生产制约等问题,同时也为其它含有来源困难或濒危中药材的中成药研究提供参考。方法:从细胞学角度及整体动物层面对复方鳖甲软肝片中紫河车的剔除及替代进行研究,并从免疫学角度对单味羊胎盘与紫河车的药效一致性进行评价。全文共分为五个部分:1.复方鳖甲软肝片中紫河车剔除或替代的初步细胞学研究取雄性SD大鼠制备对应组别的含药血清备用。将制备好的含药血清加入培养好的肝星状细胞（HSC-T6）体系中,24h后用MTT法检测各组细胞抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡情况。2.复方鳖甲软肝片中紫河车剔除或替代对急性肝损伤小鼠的影响将KM小鼠随机分为阴性对照组,模型对照组,复方鳖甲软肝片中羊胎盘0.5:1、1:1、2:1及4:1替代紫河车各剂量组（0.8436,0.8745,0.9510,1.1193g/kg）,复方鳖甲软肝片中不含紫河车剂量组（0.7662g/kg）,原复方鳖甲软肝片剂量组（0.8590g/kg）,联苯双酯剂量组（0.2g/kg）。除阴性及模型对照组ig等容量0.5%CMC-Na溶液外,其余各组均ig对应剂量的供试品溶液,每天1次,连续14d。于末次给药2h后,除阴性对照组小鼠ip等容量大豆油外,其余各组小鼠均ip 0.1%CCl4大豆油溶液诱导急性肝损伤模型。造模结束,检测各组小鼠血清生化、脂质过氧化及肝组织病理学等指标的变化。3.复方鳖甲软肝片中紫河车剔除或替代对CCl4诱导大鼠肝纤维化的影响将SD大鼠随机分阴性对照组和造模组,除阴性对照组皮下注射（sc）等容量大豆油外,造模组sc 40%CCl4大豆油溶液构建大鼠肝纤维化模型,每周2次,连续6周。造模结束后,除阴性对照组外,对存活下来的造模组大鼠进行重新分组,随机分为模型对照组,复方鳖甲软肝片中羊胎盘0.5:1、1:1、2:1及4:1替代紫河车各剂量组（0.5840,0.6054,0.6584,0.7749 g/kg）,复方鳖甲软肝片中不含紫河车剂量组（0.5305g/kg）,原复方鳖甲软肝片剂量组（0.5947g/kg）,秋水仙碱剂量组（0.1mg/kg）。从第7周开始,除阴性及模型对照组ig 0.5%CMC-Na溶液外,其余各组均ig对应剂量的供试药物直至第12周结束。给药结束,检测大鼠肝脾指数、血清生化、羟脯氨酸（Hyp）、脂质过氧化及肝纤四项（HA、LN、PC-III及C-IV）等含量变化;观察各组大鼠相同部位肝组织HE和Masson染色改变;应用免疫组化法考察肝组织中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的变化。剩余肝组织用于后续机制研究。4.复方鳖甲软肝片中羊胎盘替代紫河车对肝纤维化大鼠作用机制研究在上述试验结果基础上,首先用Elisa法检测肝纤维化大鼠肝组织中炎症介质因子（IL-6、IL-1β及TNF-α）、促肝纤维化因子（CTGF、PDGF-α）变化,再以RT-PCR法检测与肝纤维化相关的I型胶原（Col-I）、III型胶原（Col-III）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子-β（TGF-β）及基质金属蛋白酶家族相关因子mRNA表达,Western-blot法定量检测与肝纤维化相关Smad2/3、p-Smad2/3、Akt及p-Akt的表达,初步探索复方鳖甲软肝片中羊胎盘替代紫河车对肝纤维化可能的作用机制。5.单味羊胎盘与紫河车的免疫调节一致性评价（1）将KM小鼠随机分为阴性对照组,模型对照组,羊胎盘1.46,0.73,0.37g/kg剂量组,紫河车1.46,0.73,0.37g/kg剂量组。除阴性对照组ig等容量0.5%CMC-Na溶液外,其余各组小鼠均ig对应剂量的供试品溶液,每天2次,连续7d。给药结束,除阴性对照组小鼠尾静脉注射等容量生理盐水外,剩余各组小鼠均尾静脉注射稀释后的印度墨汁,取注射后1min及10min小鼠眼底静脉丛血,用分光光度计法检测小鼠血液光密度值,分析各组小鼠的廓清及吞噬指数变化,观察供试药品对小鼠碳粒廓清功能的影响。（2）在上述同样的动物分组及给药条件下,用2,4-二硝基氟苯（DNFB）致小鼠迟发型超敏反应（DTH）模型,观察单味羊胎盘与紫河车对各组小鼠耳肿胀度及肿胀率的变化。根据上述试验结果,从免疫学角度初步评价单味羊胎盘对紫河车的可替代性。结果:1.复方鳖甲软肝片中紫河车剔除或替代的初步细胞学研究血清药理学试验结果表明,复方鳖甲软肝片中紫河车剔除及用羊胎盘替代后,其大鼠含药血清对HSC-T6细胞的抑制率逐渐上升,呈浓度依赖性。其中,以10%含药血清的细胞抑制率较高。与原复方比较,剔除紫河车后的复方鳖甲软肝片对HSC-T6细胞的抑制率和凋亡率明显下降,而复方鳖甲软肝片中以羊胎盘0.5:1或1:1替代紫河车后对HSC-T6细胞的抑制率及凋亡率则显著升高。2.复方鳖甲软肝片中紫河车剔除或替代对急性肝损伤小鼠的影响复方鳖甲软肝片中不含紫河车剂量组在保肝降酶、抗脂质过氧化及肝组织病理学改善程度上与原复方鳖甲软肝片组比较均有所减弱。与模型对照组比较,复方鳖甲软肝片中羊胎盘替代紫河车各剂量组小鼠的肝脾指数、血清中AST、ALT、T-Bil、ALP及MDA水平降低,ALB、TP、SOD及GSH-Px含量升高,肝细胞水肿、气球样变及炎性细胞浸润程度减轻（P<0.01或0.05）,显示出明显的肝保护作用;与原复方比较,复方鳖甲软肝片中羊胎盘0.5:1及1:1替代紫河车的小鼠肝保护作用呈增强趋势。3.复方鳖甲软肝片中紫河车剔除或替代对CCl4诱导大鼠肝纤维化的影响与模型对照组比较,复方鳖甲软肝片中紫河车剔除后大鼠的肝脾指数、血清中AST、ALT、T-Bil、ALP、MDA、LN及C-IV水平降低,ALB及SOD含量升高,肝纤维化面积及α-SMA免疫组化阳性表达面积均减少（P<0.01或0.05）,显示一定的抗肝纤维化活性;复方鳖甲软肝片中用羊胎盘0.5:1替代紫河车后大鼠肝脾指数、血清中AST、ALT、T-Bil、GLO、ALP、Hyp、MDA及肝纤四项（HA、LN、PC-III和C-IV）水平降低,ALB、TP、SOD及GSH含量升高,肝细胞炎性细胞浸润、肝纤维化面积及α-SMA免疫组化阳性表达面积减少（P<0.01或0.05）,肝组织病理学损伤明显改善,表现出显著的抗肝纤维化作用。与原复方鳖甲软肝片组比较,复方鳖甲软肝片中紫河车剔除后抗大鼠肝纤维化作用呈减弱的趋势;复方鳖甲软肝片中用羊胎盘0.5:1替代紫河车后大鼠的抗肝纤化活性有一定程度的增强。4.复方鳖甲软肝片中羊胎盘替代紫河车对肝纤维化大鼠作用机制研究与模型对照组比较,复方鳖甲软肝片中羊胎盘0.5:1替代紫河车剂量组大鼠肝组织中IL-6、IL-1β、TNF-α、CTGF及PDGF-α含量降低,肝组织中MMP-1 mRNA表达升高,Col-I、Col-III、α-SMA、TGF-β、MMP-2及TIMP-1 mRNA表达降低,肝组织中Smad2/3、p-Smad2/3、Akt及p-Akt蛋白相对表达下调（P<0.01或0.05）;与原复方鳖甲软肝片组比较,复方鳖甲软肝片中羊胎盘0.5:1替代紫河车剂量组肝组织中p-Smad2/3及p-Akt蛋白相对表达量显著降低（P<0.01）,表明复方鳖甲软肝片中用羊胎盘0.5:1替代紫河车抗肝纤维化作用机制仍是通过抑制炎症相关因子及促纤维化因子表达,降低胶原含量,调节肝组织MMPs和TIMPs平衡,抑制HSCs活化及增殖,通过抑制TGF-β/Smad2/3及Akt信号通路表达,最终逆转肝纤维化进程。5.单味羊胎盘与紫河车的免疫调节一致性评价与模型对照组比较,单味羊胎盘1.46及0.37g/kg剂量组小鼠单核巨噬细胞的廓清及吞噬指数显著提高,小鼠耳肿胀度及耳肿胀率显著下降（P<0.01或0.05）,单味紫河车仅0.37g/kg剂量组小鼠的耳肿胀度及耳肿胀率下降显著（P<0.01或0.05）。结果表明,单味羊胎盘可能具有增强非特异性免疫功能,抑制迟发型超敏反应的作用,且略强于单味紫河车。结论:本试验条件下,在抑制HSC-T6细胞增殖、抗小鼠急性肝损伤和大鼠肝纤维化等方面,剔除处方中紫河车后的复方鳖甲软肝片略弱于原复方,而用羊胎盘替代紫河车后的复方鳖甲软肝片则明显优于原复方,其替代比例以0.5:1（羊胎盘:紫河车）为佳。另外,单味羊胎盘在增强小鼠免疫功能方面与紫河车具有一定的相似性。上述研究结果为紫河车新的中药材代用品——羊胎盘的进一步开发奠定了基础。