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研究背景及目的:随着低剂量螺旋CT(low-dose Computed Tomography,LDCT)的应用,早期肺癌包括早期肺腺癌的诊断取得了很大进展,越来越多的早期肺腺癌患者得到了手术治疗的机会。通过手术切除,早期肺腺癌患者的5年总生存率可达67%,但我们在临床实践中发现有少部分患者(约占15%)在术后1年内快速复发,其5年生存率仅为45.1%,远低于67%,这说明早期肺腺癌患者一旦快速复发则预后很差。更重要的是,我们还发现另一部分患者在术后3年内均未复发,其5年生存率则达到了惊人的94.5%。因此,我们推测早期肺腺癌可能是一种包含不同亚类的异质性极高的疾病;若将早期肺腺癌的两类患者预先区分开来,对快速复发风险高的患者可进行及早干预以改善临床结局,对迟复发患者则可避免过度医疗,这可能是目前在辅助治疗没有取得突破性进展的情况下对患者最有利的选择。当前已有许多关于早期肺腺癌复发的预测因子及生物标志物研究,包括单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)、DNA甲基化、基因panel、蛋白表达等,但价值有限且均未能应用于临床,而且更重要的是这些标志物不能用于区分快速复发患者。本研究旨在寻找能区分早期肺腺癌快速复发的预测因子,并从新的角度理解和探讨早期肺腺癌快速复发的机制。研究方法:1.早期肺腺癌复发及快速复发与临床病理特征的关系研究:对早期肺腺癌的临床病理特征与无复发生存时间(Relapse free survival,RFS)进行单因素分析,得到影响患者RFS的临床病理特征;通过Cox回归模型的多因素分析,得到影响早期肺腺癌复发的独立预测因子。将早期肺腺癌1年内复发(RFS≤12个月)和3年内未复发(RFS>36个月)的患者分别定义为快速复发与迟复发患者,采用卡方检验比较两组患者的临床病理特征从而得到其中有统计学差异的指标。2.早期肺腺癌快速复发的基因芯片研究:提取20例(8例快速复发,12例迟复发)早期肺腺癌患者石蜡包埋肿瘤组织的RNA,进行基因表达谱芯片检测。将基因芯片数据导入软件Transcriptome Analysis Console(TAC)3.0.0得到基因聚类热图。通过limma软件包分析得到两组患者的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs);对DEGs进行GO(Gene Ontology,基因本体论)功能富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)信号通路分析,得到差异显著的功能富集结果;对DEGs进行蛋白相互作用(protein–protein interaction,PPI)网络分析,得到其中的关键基因。增加患者例数后对得到的免疫相关的关键基因IL-1β和PTGS2进行免疫组化(immunohistochemistry,IHC)染色,分析其蛋白表达水平对早期肺腺癌RFS的影响,同时通过卡方检验比较其蛋白表达水平在快速复发与迟复发患者中的差异。对患者肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)的标志包括CD3、CD4、CD8和CD20进行IHC染色,比较两组患者TILs浸润程度的差异。3.早期肺腺癌快速复发的免疫组库研究:提取39例(20例快速复发,19例迟复发)早期肺腺癌患者石蜡包埋肿瘤组织的DNA,通过多重PCR扩增技术对B细胞受体(B cell receptor,BCR)重链(IGH)及T细胞受体(T cell receptor,TCR)β链(TRβ)可变区的互补决定区3(complementarity determining area 3,CDR3)进行扩增,利用Illumina Hiseq3000平台进行超深度测序并对测序结果进行统计学及生物信息学分析。通过热图展示每名患者对于各个V基因片段(variable gene segment)、J基因片段(joining gene segment)的使用频率,并分组进行比较以得出两组患者间具有统计学差异的IGHV、IGHJ、TRβV、TRβJ基因。分组比较两组患者的基因重排组合以得到具有统计学差异的IGHV/J以及TRβV/J。计算BCR和TCR克隆的多样性指数Clonality和Evenness以评价两组患者克隆多样性的差异。将BCR和TCR的克隆频率分为5个等级(稀有、低、中、高、超高)并分组进行比较,探讨每个等级的克隆分布在两组患者间是否存在差异。4.APE1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1)对肺腺癌免疫微环境的影响:将小鼠Lewis细胞接种于APE1基因敲除(knock-out,KO)小鼠及野生型(wildtype,WT)小鼠,取肿瘤组织并分离免疫细胞后用CD8+T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、MDSC的相应抗体标记,流式细胞仪检测上述细胞。研究结果:1.早期肺腺癌复发及快速复发与临床病理特征的关系研究:单因素分析结果表明,肿瘤的大小及组织学类型是影响早期肺腺癌患者复发的因素。Cox多因素分析进一步表明肿瘤直径>2cm和非贴壁为主型的组织学类型是影响早期肺腺癌患者RFS的独立危险因素,其风险比(Hazard Ratio,HR)分别为2.688(95%CI:1.211-5.920)和2.040(95%CI:1.006-4.135),P<0.05。卡方检验结果表明,快速复发与迟复发患者的组织学类型和分化程度存在显著差异,前者的非贴壁为主型和低分化程度的人数占比明显高于后者,分别为95.5%vs 71.1%、54.5%vs 23.9%,P<0.05。2.早期肺腺癌快速复发的基因芯片研究:基因聚类热图结果表明,早期肺腺癌快速复发与迟复发患者从基因层面上基本可以各归为一类。通过Limma分析得到416个DEGs,对这些DEGs进行GO富集分析发现其与免疫功能密切相关:在排行前10项的功能类别里,细胞成分中有2项(2/10)、分子功能中有2项(2/10)、生物学过程中有9项(9/10)涉及免疫功能。KEGG分析结果表明具有统计学差异的8项通路中有6项涉及免疫或炎症。通过PPI网络分析从416个DEGs中鉴定出10个关键基因,包括与免疫或炎症密不可分的IL-1β和PTGS2。免疫组化及Kaplan-Meier分析表明IL-1β低表达患者组的中位RFS更低(21.5个月vs 55.0个月),P<0.05;卡方检验进一步表明IL-1β低表达患者人数在快速复发组中的比例更高(31.8%vs 8.1%,P<0.05)。PTGS2的结果与IL-1β类似,即PTGS2低表达患者的中位RFS更低(19.0个月vs 77.0个月,P<0.05),PTGS2低表达患者人数在快速复发组中占比更大(68.2%vs 10.8%,P<0.05)。IHC结果显示TILs低浸润的患者人数比例在快速复发组中更高,分别为CD3(81.8%vs 54.1%),CD4(86.4 vs 55.4%),CD8(90.9%vs 62.6%),CD20(95.5%vs71.6%),P<0.05。3.早期肺腺癌快速复发的免疫组库研究:⑴在V、J基因的使用频率方面:对于BCR而言,两组患者共存在4个差异基因(IGHV1-69D、IGHV3-NL1、IGHV4-59和IGHJ2)且均在快速复发患者中的使用频率更高;对于TCR则存在6个差异基因,其中TRβV6-9在快速复发组中使用频率更高,TRβV3-2、TRβV6-1、TRβV6-4、TRβJ1-4、TRβJ2-6在迟复发组中的频率更高。⑵在V/J基因重排方面:对于BCR而言,两组患者有8个差异的重排组合,其中IGHV3-43/IGHJ6,IGHV3-NL1/IGHJ3,IGHV3-69-1/IGHJ5,IGHV1-18/IGHJ3在快速复发患者中的出现频率更高,而IGHV3-23D/IGHJ6,IGHV3-11/IGHJ6,IGHV3-23/IGHJ6,IGHV3-11/IGHJ2在迟复发组中的频率更高(IGHV3-11/IGHJ2仅出现在迟复发组);对于TCR而言,两组患者有23个差异重排组合,其中TRBV14/TRBJ2-4,TRBV7-8/TRBJ1-4,TRBV3-1/TRBJ1-3,TRBV5-1/TRBJ2-4,TRBV13/TRBJ2-7,TRBV5-1/TRBJ1-4,TRBV4-1/TRBJ2-1,TRBV5-6/TRBJ1-1,TRBV4-3/TRBJ2-2,TRBV9/TRBJ2-1,TRBV6-1/TRBJ1-3,TRBV6-9/TRBJ2-7,TRBV3-2/TRBJ2-7在快速复发组中的频率更高(TRBV6-9/TRBJ2-7和TRBV3-2/TRBJ2-7仅出现在快速复发组),而TRBV28/TRBJ1-4,TRBV10-3/TRBJ2-3,TRBV7-9/TRBJ1-1,TRBV2/TRBJ2-2,TRBV6-6/TRBJ2-4,TRBV4-1/TRBJ2-2,TRBV12-5/TRBJ1-1,TRBV6-3/TRBJ2-5,TRBV10-2/TRBJ1-4,TRBV16/TRBJ1-1在迟复发组中的频率更高(TRBV16/TRBJ1-1仅出现在迟复发组)。⑶BCR及TCR的克隆多样性指数Clonality和Evenness方面:对于BCR,两组患者的Clonality和Evenness无显著差别;对于TCR,快速复发患者TCR克隆的Clonality更高,Evenness更低,即其TCR克隆的多样性低于迟复发患者。⑷BCR和TCR的克隆频率的分布方面:两组患者的BCR和TCR的频率分布均无显著差异。4.APE1对肺腺癌免疫微环境的影响:APE1 KO小鼠肿瘤浸润的功能性CD8+T细胞、树突状细胞均明显少于WT小鼠,而肿瘤浸润性的MDSC明显多于WT小鼠。研究结论:1.早期肺腺癌患者临床病理特征中的肿瘤大小(>2cm)和组织学类型(非贴壁为主型)是肿瘤复发的独立危险因素;而组织学类型和分化程度对于区分快速复发与迟复发患者具有一定的提示作用。2.快速复发与迟复发的早期肺腺癌患者在免疫相关分子、免疫功能相关的富集通路、肿瘤淋巴细胞浸润等方面存在显著差异。3.早期肺腺癌患者BCR及TCR特定的V或J基因使用频率、V/J基因重排组合对于区分快速复发与迟复发患者具有指示意义;TCR的克隆多样性降低可能是早期肺腺癌快速复发的重要原因。4.APE1能影响小鼠肺腺癌移植瘤的浸润性免疫细胞比例从而干预肿瘤免疫功能,这可能是APE1影响早期肺腺癌复发的重要原因。