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目的:构建人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)真核表达载体,并探讨其抗乙型肝炎病毒(HBV)复制的作用。
方法:
1.采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞(PBMC)中克隆APOBEC3G基因编码区片段,构建pcDNA3.1-A3G真核表达载体,经HindIII和EcoRI双酶切初步鉴定后,送测序;将真核表达载体pcDNA3.1-A3G分别转染HepG2和HL7702细胞,采用PT-PCR、免疫细胞化学、Western blot检测APOBEC3G真核细胞中的表达情况。
2.利用脂质体转染法将真核表达载体peDNA3.1-A3G转染能分泌HBV的HepG2.2.15细胞,分别于转染后24h、48h、72h,收集细胞培养上清液和细胞总蛋白,Western blot检测HBx蛋白表达情况,ELISA法检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达情况。
结果:
1.测序结果显示pcDNA3.1-A3G真核表达载体中APOBEC3G序列正确,经RT-PCR、免疫细胞化学、Western blot检测到APOBEC3G在HepG2和HL7702真核细胞中基因转录和表达。
2.HepG2.2.15细胞经APOBEC3G蛋白干扰后,HBx、HBsAg和HBeAg表达量逐渐降低,于72h见表达量显著降低。
结论:
1.成功构建了APOBEC3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G;
2.APOBEC3G在体外可以抑制HBV复制,为深入研究APOBEC3G作为抗HBV药物提供实验基础。