背景
　　酸中毒是指酸-碱平衡失调，酸的增加或碱的减少，其本质是pH值的下降。酸中毒是局部缺血的共同特征，在脑缺血等神经系统疾病中，酸中毒是引起神经元损伤的主要原因。脑缺血时，迫使脑主要供能方式由葡萄糖氧化向无氧糖酵解转变，此时糖酵解副产物乳酸的积累及ATP水解产生的质子导致脑内pH值下降。高尔基体是一种高度动态的膜结合细胞器，能将内质网合成的蛋白质进修饰、分拣与运输，然后运送到细胞特定部位或分泌到细胞外，许多高尔基基质蛋白，包括GRASP55和GRASP65和Golgins，它们共同维持高尔基的结构和功能。在许多脑缺血/再灌注模型及神经退行性疾病中观察到神经元中大量高尔基碎片堆积。在神经元中，高尔基体结构的改变会损害其精确的加工和分选相应蛋白到神经元特定区域的功能，进而损害神经元功能。因此，维持高尔基体结构的稳定对神经元的形态和功能十分重要。
　　目的
　　1、研究酸性环境介导的神经元高尔基体破碎对自噬的影响。
　　2、研究酸性环境介导的神经元高尔基体破碎对神经元形态的影响。
　　3、研究GRASP65在酸性环境介导的神经元高尔基体破碎、自噬变化及形态损伤方面的保护作用。
　　方法
　　选用怀孕18天左右的SD大鼠，进行原代神经元的培养。神经元培养至14天时，进行pH6.5处理。然后利用细胞免疫荧光技术观察神经元高尔基体结构及神经元的形态变化，运用免疫印迹技术检测GRASP65和自噬相关蛋白的变化。
　　随后，在神经元培养至第7天时，通过慢病毒感染技术在原代神经元中过表达GRASP65，当神经元培养至14天时，再进行pH6.5处理。然后同样利用细胞免疫荧光技术观察神经元高尔基体结构及神经元的形态变化，运用免疫印迹技术检测自噬相关蛋白的变化。
　　结果
　　1、酸性环境诱导神经元高尔基体破碎。
　　对培养至14天的原代神经元进行pH6.5处理24小时(pH6.5组)，通过细胞免疫荧光，用GM130标记高尔基体，结果观察到高尔基体形态出现了破碎，高尔基体由折叠状破碎成片段状或点状，且与正常对照组相比pH6.5组高尔基体碎片数显著增加，高尔基体碎片的表面积明显降低。
　　2、酸性环境导致神经元GRASP65水平显著下降。
　　通过免疫印迹检测发现，与正常对照组相比pH6.5组神经元GRASP65下降了32%，Golgin84下降了26%，GRASP55、TGN46水平未发生变化。
　　3、蛋白质组学分析结果显示：酸性环境造成神经元自噬、溶酶体、极性及突触相关蛋白的异常。
　　对pH6.5组和正常对照组神经元进行蛋白质组学分析。结果共检查到了5460个蛋白，并对4716个蛋白进行了定量分析。与正常对照组相比pH6.5组共有637个差异蛋白，其中上调259个蛋白，下调378个蛋白。差异蛋白中包括溶酶体、自噬相关差异蛋白，极性相关差异蛋白，突触相关差异蛋白。
　　4、酸性环境导致自噬相关蛋白p62水平降低、LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin1水平增加，酸性环境诱导的高尔基体破碎可能导致神经元自噬水平增强。
　　通过免疫印迹检测发现，与正常对照组相比pH6.5组神经元p62降低27%，LC3Ⅱ/Ⅰ增加32%，Beclin1增加56%，说明酸性环境下神经元自噬水平增强。
　　5、酸性环境下高尔基体破碎可能导致神经元形态损伤。
　　通过细胞免疫荧光，用MAP2标记神经元树突，经过Sholl分析发现，与正常对照组相比pH6.5组神经元树突总长度缩短，神经元树突分枝数减少，树突复杂性降低，说明酸性环境损伤了神经元形态。
　　6、过表达GRASP65可逆转酸性环境下神经元高尔基体破碎、自噬水平的增强及神经元形态的损伤。
　　在原代神经元中过表达GRASP65，并进行pH6.5处理24小时(过表达组)。通过免疫印迹检测发现，与pH6.5组相比过表达组GRASP65增加56%，同时p62增加43%，LC3Ⅱ/Ⅰ降低17%，Beclin1降低32%，自噬水平降低。通过高尔基体免疫荧光观察到，与pH6.5组相比过表达组神经元高尔基体碎片数显著减少，高尔基体碎片的表面积明显增加。通过神经元树突免疫荧光及Sholl分析发现，与pH6.5组相比过表达组神经元树突总长度增长，神经元树突分枝数增多，树突复杂性增加。所以过表达GRASP65可逆转酸性环境下神经元高尔基体破碎、自噬水平的增强及神经元形态的损伤。
　　结论
　　酸性环境诱导神经元GRASP65水平降低，导致神经元高尔基体破碎，进而引起神经元自噬水平的增强和形态的损伤。而过表达GRASP65可逆转酸性环境引起的神经元高尔基体破碎、自噬水平的增强及神经元形态的损伤。