大猿叶甲（Colaphellus bowringi Baly）属鞘翅目（Coleoptera）,叶甲科（Chrysomelidae）,无缘甲属（Colaphellus）,地理分布广泛,是我国为害十字花科蔬菜的一种重要农业害虫。有研究表明,mpp5Ab1基因编码一种苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）分泌型杀虫蛋白,在大肠杆菌中表达的蛋白对大猿叶甲幼虫具有高毒性,但作用机制尚不清楚。寻找大猿叶甲幼虫中肠中与Mpp5Ab1杀虫蛋白的互作蛋白是探索Mpp5Ab1对大猿叶甲幼虫杀虫机制的一项重要工作,可为大猿叶甲的生物防治提供理论基础。本文中首先通过酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid,Y2H）对大猿叶甲中肠c DNA文库进行了筛选,而后通过Pull-down与双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation,Bi FC）对筛选结果进行了进一步的验证。本研究首先通过GAL4酵母双杂交系统对大猿叶甲中肠c DNA文库中的Mpp5Ab1互作蛋白进行筛选。以大猿叶甲幼虫为研究对象,提取其中肠组织的总RNA,利用SMART（Switching Mechanism At 5’end of RNA Template）技术和长距离PCR合成双链c DNA,连接、转化后得到大猿叶甲中肠c DNA文库,该文库滴度、插入片段大小以及平均插入片段大小均符合建库要求。从实验室保存的p ET21b-mpp5Ab1质粒中克隆了去除N-端信号肽的mpp5Ab1基因,并将其克隆至p GBKT7质粒中,得到重组诱饵质粒p GBKT7-mpp5Ab1。经自激活与毒性检测实验,表明该诱饵质粒不具备自激活现象,同时对酵母菌株不产生毒性。使用Anti-Myc单克隆抗体对诱饵菌株中表达的融合蛋白进行Western Blot检测,结果表明诱饵蛋白能够在酵母菌株中正常表达,符合酵母双杂交文库筛选所需标准。通过Mating法,以p GBKT7-mpp5Ab1为诱饵对大猿叶甲中肠c DNA文库进行筛选,杂交液在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp缺陷培养基上共长出7个单菌落,测序结果表明7个阳性克隆共编码3种蛋白质。经NCBI比对,这3个基因分别编码Tre1（Trapped in endoderm 1）、CRFR2（Corticotropin-releasing factor receptor 2）和氨肽酶N（Aminopeptidase N,APN）蛋白,将这3个基因分别命名为Cb Tre1、Cb CRFR2和Cb APN。提取质粒进行回交验证,实验结果显示含Cb Tre1、Cb CRFR2和Cb APN基因的质粒与诱饵质粒的共转化组均能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上生长,与p GBKT7空载体的共转化组均不能生长,表明候选基因在该缺陷平板上不具备自激活活性。为验证酵母双杂交的筛选结果,构建了用于Pull-down实验的表达载体p GEX-Cb Tre1、p GEX-Cb CRFR2和p GEX-Cb APN,使3个蛋白均能够与GST标签融合表达,增加了外源蛋白的可溶性。通过Pull-down验证Mpp5Ab1与Cb Tre1、Cb CRFR2和Cb APN间的互作情况,结果显示3组共同孵育的洗脱液中未能检测到Mpp5Ab1-His融合蛋白。下一步验证通过Bi FC技术进行,采用红色荧光蛋白m Cherry作为报告基因,将Mpp5Ab1与m Cherry的C-端片段相融合,将Cb Tre1、Cb CRFR2和Cb APN与m Cherry的N-端片段相融合,成功构建4个Bi FC表达载体mpp5Ab1-Myc Cm Cherry p Blue、Cb Tre1-HANm Cherry p Blue、Cb CRFR2-HANm Cherry p Blue以及Cb APN-HANm Cherry p Blue。Bi FC实验结果显示显微镜下共转化的昆虫细胞中未观察到红色荧光。根据以上结论,研究结果为Mpp5Ab1蛋白的杀虫机制的研究提供了理论依据,为大猿叶甲的生物防治提供了理论参考。