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木质纤维素生物质是生物燃料、制浆造纸、畜禽饲料和其他生物产业的一种有前途的资源,包括农林废弃物、药用植物非药用部位及中药植物药渣等。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素(木聚糖、甘露聚糖、木葡聚糖及β-1,3/1,4-葡聚糖等)和木质素组成,其高效降解需要纤维素酶和木聚糖酶等酶的协同作用。研究具有良好热稳定性且对木聚糖和纤维素都有活性的糖苷水解酶(GHs)不仅可以提高木质纤维素的水解效率,而且有利于降低酶制剂的使用成本,具有广阔的应用前景。在碳水化合物活性酶(CAZy)数据库中,一些GH10家族糖苷水解酶表现出底物杂泛性,除了能够水解木聚糖外,还对纤维素底物、大麦葡聚糖和番茄苷等表现出水解活性。本研究从广州大学城一处落叶林(23° 03’N,113° 23’E)土壤中分离得到一株具有木聚糖降解能力的菌株,经16S rDNA鉴定和分析后将其命名为Bacillus sp.KW1。通过对其进行基因组草图测序和注释,鉴定出五个编码木聚糖降解酶的基因,所编码的蛋白分别为GH10家族内切木聚糖酶BaXyn10A、GH11家族内切木聚糖酶BaXyn11A、GH30家族葡萄糖醛酸木聚糖酶BaXyn30A、GH43家族阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖水解酶BaAXH43A和GH43家族β-木糖苷酶BaXylo43A,它们与已表征生化特征的酶的最高序列一致性分别为88%、99%、87%、89%和98%。基因克隆和原核表达的结果表明以上五个酶均可以在大肠杆菌中进行异源可溶性表达。鉴于GH10家族酶的底物杂泛性,因此本研究优先对BaXyn1OA进行酶学性质表征,分析结果发现该酶是一个热稳定性的双功能木聚糖酶/纤维素酶,其最适反应pH和温度分别为pH 6.0和65℃,在pH 6.0-11.0缓冲液中25℃孵育12 h仍能保持超过80%活性,在65℃、70℃下的半衰期分别为12 h和1.5h;该酶具有宽泛的底物谱,对木聚糖、木寡糖、pNPX、pNPC、pNPG、CMC、纤维寡糖、滤纸和Avicel都有水解活性。在已生化鉴定的GH10家族酶中,与BaXyn10A序列相似性最高(88%)的为来源于Bacillus sp.HJ14的单功能木聚糖酶(对CMC无水解活性);此外BaXyn1OA与其他GH10家族酶包括双功能木聚糖酶/纤维素酶的序列一致性不超过30%。以上结果表明BaXyn10A是一个新型的GH10家族的双功能木聚糖酶/纤维素酶。为了研究BaXyn1OA与其他四个酶的协同作用,本研究分别对另外四个木聚糖降解酶的最适反应pH和温度、底物水解特性进行了初步鉴定。在此基础上,本研究以BaXyn1OA为核心酶,研究添加其他酶对水解木聚糖的影响,结果显示逐步添加其他四个酶能不同程度地促进对木聚糖的水解,其中由五个酶组成的复合酶的水解效果最好,在水解小麦阿拉伯木聚糖和榉木木聚糖中释放的还原糖分别比单独的BaXyn1OA提高了 53.2%和29.4%。说明它们之间存在一定的协同作用,三个木聚糖酶的功能既有重叠也有差异;另外,也表明Bacillus sp.KW1可通过这些酶的协同作用来水解木聚糖,为自身提供能量和碳源。进一步研究五酶复合物对不同木聚糖的最适反应温度,结果显示复合酶对小麦阿拉伯木聚糖和榉木木聚糖最适反应温度分别为50℃和60℃,说明底物不同,复合酶中的发挥主要作用的组分不同;针对环境中的不同底物,Bacillus sp.KW1可通过调控木聚糖降解酶的构成来进行高效降解。最后,为了测试双功能木聚糖酶/纤维素酶在天然木质纤维素的实用性,本论文还研究了 BaXyn1OA协同商品纤维素酶水解预处理的玉米秸秆和中药药渣(甘草、当归和黄芪)的效果,结果显示复合酶所释放的还原糖量要明显高于使用商品纤维素酶单酶的。在水解预处理的玉米秸秆中,复合酶0.4UFP Celluclast 1.5 L+4UBirwx BaXyn1OA 所释放的还原糖量比单酶 0.4UFPCelluclast 1.5L 所释放的要高出了 84.2%。在水解预处理的甘草药渣中,复合酶0.4 UFPCelluclast 1.5 L+4 UBirWX BaXyn1OA所释放的还原糖量比单酶0.4 UFP Celluclast 1.5 L所释放的要高出了 85.8%。在水解预处理的当归和黄芪药渣中,复合酶0.4 UFP Celluclast 1.5 L+2 UBirWX BaXyn10A 所释放的还原糖量比单酶 0.4 UFP Celluclast 1.5 L所释放的要分别高出了 52.0%和41.6%。说明BaXyn1OA对商品纤维素酶Celluclast 1.5 L具有良好的协同作用。综上,本论文从土壤中分离了一株耐热且具有良好热稳定性的菌株Bacillus sp.KW1,并从中鉴定出五个木聚糖酶基因进行基因克隆和原核表达。对其中的BaXyn1OA进行系统性的酶学性质分析,发现该酶是一个具有良好热稳定性的双功能木聚糖酶/纤维素酶。以BaXyn10A为核心酶,研究其与其他四个酶之间的协同作用,发现逐步添加其他四个酶能不同程度地促进对木聚糖的水解,其中由五个酶组成的复合酶的水解效果最好。BaXyn1OA对商品纤维素酶Celluclast 1.5 L具有良好的协同作用,有利于其的商品化开发和木质纤维素资源的高效利用。