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氮素是植物生长发育必需的营养元素,也是农业生产过程中化肥施用最多的元素。在其他营养元素均得到满足时,对于大多数农作物产量增加而言,土壤中的氮素是限制因素。硝酸盐是土壤中氮素存在和多数植物吸收利用氮素的主要形态,但硝酸盐很容易溶解在土壤溶液里,造成氮素营养的流失,威胁环境。植物在吸收利用硝酸盐的的过程中硝酸盐转运蛋白起着关键作用,研究硝酸盐转运蛋白对提高植物氮素利用效率,提高农业产量,解决因氮素流失造成的环境污染等问题具有重要的意义。对矮珍珠(Glossostigma elatinoides)、小水榕(Anubias nana)、黑藻(Hydrilla verticillata)、金鱼藻(Ceratophyllum demersum)等20种水生植物的生长速度进行研究发现,矮珍珠、金鱼藻、黑藻和小水榕的生长速度最快,0.5g健壮茎枝生长4周后湿重分别增长362%、372%、376%和402%。为了克隆这些植物中的硝酸盐转运蛋白编码基因,本研究对GenBank中已知的硝酸盐转运蛋白的氨基酸序列进行比对,得到保守序列,设计简并引物,进行PCR扩增,成功从矮珍珠中克隆得到硝酸盐转运蛋白编码基因GeNRT1.1、GeNRT2.1。多形汉逊酵母基因组中只有一个硝酸盐转运蛋白编码基因(YNT1),缺陷型多形汉逊酵母(△ynt)在氮素存在的条件下不能正常生长,基于这一原理,本研究利用缺陷型多形汉逊酵母外源表达系统对矮珍珠硝酸盐转运蛋白GeNRT1.1、GeNRT2.1和硅藻(Cylindrotheca fusiformis)硝酸盐转运蛋白CfNAT进行功能鉴定。主要研究进展如下:1.成功从矮珍珠(Glossostigma elatinoides)中克隆得到低亲和硝酸盐转运蛋白基因GeNRT1.1并进行了Genebank登录,登录号为KX237655,该基因序列全长1797bp,包含1440bp的完整的开放阅读框,编码480个氨基酸。和烟草、拟南芥已知低亲和硝酸盐转运蛋白具有较高的序列相似性74.1%和62.4%。将该基因转化缺陷型多形汉逊酵母(△ynt)发现,能使缺陷型酵母恢复生长,表明GeNRT1.1具有硝酸盐转运功能,其Km值为1200μM。一般认为,当Km<1000μM为高亲和转运蛋白;当Km>1000μM为低亲和转运蛋白,因此GeNRT1.1应该是一种低亲和硝酸盐转运蛋白。实时荧光RT-PCR检测发现,GeNRT1.1在茎和叶中的表达量较高,是根中表达量的3.5倍。在高浓度硝酸盐(2mM)诱导下,GeNRT1.1基因在根、茎、叶中表达量均高于低浓度(0.5mM),该结果进一步证实GeNRT1.1是一种低亲和硝酸盐转运蛋白。2.成功从矮珍珠中克隆得到高亲和硝酸盐转运蛋白基因GeNRT2.1,并进行了Genebank登录,登录号:KX230796。该基因全长2078bp,包含1596bp的完整的开放阅读框,编码530个氨基酸。氨基酸序列分析表明GeNRT2.1是跨膜蛋白,属于MFS家族。将该基因转化缺失YNT1的多形汉逊酵母(△ynt),在培养基中硝酸盐浓度低到500μM时表达了GeNRT2.1的多形汉逊酵母(△ynt)仍可正常生长,Km值约为041μM,这表明GeNRT2.1基因是一个高亲和硝酸盐转运蛋白基因。实时荧光定量RT-PCR结果表明,GeNRT2.1在根中表达量最高,且受到低浓度NO3-的诱导,在500μM环境中表达量上调,进一步证明GeNRT2.1为高亲和硝酸盐转运蛋白。3.为研究目的基因的亚细胞定位,分别构建植物表达载体p35S::GeNRT1.1-GFP/RTL和p35S::GeNRT2.1-GFP/RTL转入拟南芥原生质体,激光共聚焦显微镜观察发现,p35S::GeNRT1.1-GFP/RTL-和p35S::GeNRT2.1-GFP/RTL均定位于原生质体的细胞膜上,这表明GeNRT1.1和GeNRT2.1编码的是一种膜蛋白。4.比较GeNRT1.1、GeNRT2.1和CfNRT对缺陷型酵母的影响发现,△ynt-CfNRT、△ynt-GeNRT1.1和△ynt-GeNRT2.1在相同时间里对硝酸盐的吸收速率不同。相同的条件下转△ynt-CfNRT能够更快的达到吸收速率的最大速度,这预示CfNRT的功能可能比GeNRT1.1、GeNRT2.1更强。5.CfNRT对转基因烟草生长的影响。为验证CfNRT基因在转基因烟草中的功能,我们将T2代转基因烟草、非转基因烟草分别播种在MS0、3?6 N、2?6 N、1?6 N、1/16 N、1/32 N(氮含量分别为MS0培养基中氮含量的3/6、2/6、1/6、1/16、和1/32)培养基中,T2代转基因烟草播种27天发现,在MS0培养基中的转基因、非转基因烟草苗生长状况没有明显差别,3?6 N培养基中的转基因烟草比播种在相同培养基中的非转基因烟草的叶片大1-3倍、颜色浓绿。1/16 N培养基中的转基因烟草生长情况良好,缺氮症状不明显,非转基因烟草生长明显受到抑制。播种后61d测定转基因烟草、非转基因烟草鲜重、干重发现:烟草在MS0过量氮至1/6 N的条件下,单株鲜重及干重基本维持在同一水平(鲜重138.0-201.3 mg;干重16.6-29.9 mg),当氮降至1/16及1/32时,植物生长受到明显抑制,鲜重(30.8-65.5 mg)及干重(5.3-10.0 mg)显著降低。但转基因烟草鲜重和干重都高于非转基因烟草。节氮结果表明,如果以1/8 N为标准,转基因烟草可节约50%氮使用量。