21世纪是器官移植、微创手术、基因治疗的时代,作为“医学之巅”的器官移植已经成为治疗终末期病变和器官功能衰竭的一种最有效的方法。随着外科技术的改进,免疫抑制剂的发展,我国的肝移植已取得了很大的进步,术后1年存活率已达到90%以上,接近或达到国际先进水平。在供肝日益短缺的大背景下,供肝匮乏已成为制约肝移植进一步发展的世界性难题,在我国,供、受者之比高达150：1。卫生部大力推行的心死亡器官捐献(donation after cardiac death, DCD),是我国现阶段解决器官来源的科学决策。但与脑死亡和活体肝移植相比,DCD移植远期预后效果差,并发症发生率高。目前多数学者认为影响DCD肝移植效果的主要原因在于热缺血时间延长导致的严重再灌注损伤,随着我国DCD器官移植广泛的开展,如何进一步降低缺血再灌注(ischemia reperfusion, I/R)损伤,提高DCD移植效果将具有极其重要临床意义。目前I/R损伤的机制还不甚明了,但对其本质实为急性炎症反应已达成共识,而肝脏内固有巨噬细胞即枯否细胞(Kupffer cell,KC)是导致急性期炎症反应的“罪魁祸首”。KC在肝脏I/R损伤中的作用还存在诸多争议,尤其在肝移植伴有内毒素血症这种复杂的I/R中的作用尤其值得重视。外周血的巨噬细胞进入组织后,受局部微环境的影响,表现出不同的免疫应答,获得不同的功能表型即极化,发挥促炎或抗炎两种截然相反的作用。KC在肝脏I/R损伤中是否也存在极化状态?而这种极化是不是导致其功能差异的原因所在?以及调控KC表型是否可以减轻肝脏损伤?这些都是值得探索的问题,将有利于从多方面,多角度深入探讨KC表型和肝脏I/R损伤关系,明确关键性作用机制及具体环节,为临床肝切除和肝移植过程中I/R损伤的防治以及临床药物研发打下坚实的理论基础。巨噬细胞极化的分子机制尚未完全阐明。近年来,基因组学、转录组学和表观遗传学的研究极大促进了对其调控机制的认识。表观遗传学领域发展迅速,相关研究方兴未艾,基本上已涉及到所有的病理生理过程,其中一个重要的部分就是组蛋白乙酰化修饰；更为可喜的是,表观遗传药物包括组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制剂丁酸钠、TSA、SAHA等已作为抗癌药物,通过逆转表观遗传性状,正进入临床试验阶段；而在动物研究中,HDAC抑制剂的使用已远远超出了其‘适应症”,发挥抗炎、免疫调节等作用。本文也探讨了丁酸钠,主要来自大肠中厌氧杆菌对碳水化合物和纤维素的酵解,对肝脏I/R损伤的影响,以期为临床新药的研发提供新的思路和理论基础。第一部分丁酸钠对Kupffer细胞表型的影响及在部分肝脏缺血再灌注损伤中的作用目的：探讨KC在部分肝脏I/R损伤中表型演变规律,HDAC抑制剂丁酸钠对其影响及在I/R损伤中的作用。方法：SD雄鼠随机分为四组(n=8-10)：假手术组(Sham)、模型组(Vehicle)、丁酸钠小剂量组(Butyrate 100mg/Kg)和大剂量组(Butyrate 300mg/Kg)。各组于缺血前30分钟分别经阴茎背静脉注射相应剂量的生理盐水或丁酸钠,建立70%部分肝I/R模型,再灌注后3h、6h、12h或24h后采血、取样,分别检测丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotrans ferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)水平、肝组织髓过氧化物酶(myeloperoxtidase,MPO)活性、病理组织学改变,并采用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-PCR)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, Elisa)检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白介素-6 (interleukin-6, IL-6)表达,同时测定肝脏M1型标志物：诱导型一氧化氮合成酶(induced nitric oxide synthase, iNOS)、CD16、白介素-12(interleukin-12, IL-12), M2型标志物：精氨酸酶Ⅰ(arginase I, Argl)、 CD206、白介素-10(interleukin-10, IL-10)的表达。体外观察Raw 264.7细胞经丁酸钠预处理,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激后M1、M2型标志物的表达。免疫组化检测肝脏iNOS、Ar gl及Cleaved Caspase-3、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表达。结果：再灌注后,模型组ALT, AST明显升高,肝脏坏死严重,中性粒细胞浸润明显。炎症因子水平、MPO活性及M1型相关标志物表达升高。丁酸钠干预后,尤其是大剂量,能够明显改善肝脏损伤,降低炎症因子水平,诱导M2型相关分子表达；并降低肝细胞凋亡,促进肝细胞增殖。体外丁酸钠可诱导LPS刺激的Raw 264.7细胞由M1型向M2型转变。结论：丁酸钠干预能能够减轻大鼠肝脏I/R引起的炎症因子升高和中性粒细胞浸润,有效改善肝功能损害和促进修复,可能和诱导KC从M1型向M2型转变有关。第二部分全肝和部分肝脏缺血再灌注损伤模型中Kupffer细胞表型的差异目的：全肝和部分肝脏I/R损伤模型中KC表型的差异。方法：SD雄鼠随机分为三组：假手术组(Sham)、全肝I/R损伤组(Total I/R)、部分肝脏I/R损伤组(Partial I/R),再灌注6h、24h后采血、取样,分别检测肝脏ALT、AST水平,病理组织学改变,并采用RT-PCR、Elisa检测TNF-α、IL-6表达,同时检测肝脏M1型标志物(iNOS、CD16、IL-12)、M2型标志物(Argl、CD206、IL-10) mRNA表达。各组分别Elisa检测检测门静脉内毒素水平。结果：再灌注后,两模型组ALT、AST明显升高,炎症因子水平升高,肝脏坏死严重。全肝I/R损伤组倾向表达M2型标志物,部分肝脏I/R损伤组倾向于表达M1型标志物。全肝I/R损伤组内毒素水平升高。结论：全肝和部分肝脏I/R损伤模型中存在KC表型差异,可能和内毒素水平有关。第三部分丁酸钠对全肝缺血再灌注损伤的影响目的：探讨丁酸钠对全肝I/R损伤的影响。方法：SD雄鼠随机分为3组：假手术组(Sham)、模型组(Vehicle)、 丁酸钠组 (Butyrate)。各组于缺血前30分钟分别经阴茎背静脉注射相应剂量的生理盐水或丁酸钠,建立全肝I/R模型,再灌注6h、24h后采血、取样,分别检测ALT、AST水平；肝组织MPO活性；肝脏及小肠病理组织学改变,并采用RT-PCR、Elisa检测TNF-α、IL-6表达,并测定门脉内毒素含量变化。扫描电镜及透射电镜观察小肠粘膜显微变化。免疫组化及Western blot检测小肠紧密连接蛋白ZO-1的表达。结果：再灌注后模型组A LT、AST明显升高,肝脏坏死严重,中性粒细胞浸润,伴小肠粘膜损伤,紧密连接蛋白表达降低,炎症因子以及内毒素水平升高。丁酸钠干预后,能够明显改善肝脏损伤,减轻肠道粘膜损害,维持屏障功能,降低炎症因子和内毒素水平。结论：丁酸钠能够减轻肠道粘膜紧密连接蛋白损害,保护肠道粘膜屏障功能,减少炎症因子和内毒素水平,降低中性粒细胞浸润从而有效改善肝功能损害和病理损伤。