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目的
如何预防和阻止脏器缺血/再灌注(FR)损伤,尤其是肠道I/R损伤,是临床治疗重度创伤/失血性休克(T/HS)、感染性休克、胸腹主动脉瘤手术和脏器移植中减少和降低系统性炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能不全综合征(MODS)的重要课题。研究高压氧干预治疗、维持肠道有氧代谢和预防其I/R损伤的机制和治疗方案是创伤、血管外科、脏器移植领域崭新的课题。本实验应用单层人类大肠粘膜上皮细胞Caco-2建立离体肠道缺血再灌注损伤模型,研究高压氧对缺血再灌注损伤中肠道上皮通透性和肠道上皮细胞间紧密连接结构蛋白转录水平的影响,探讨高压氧干预的机制,以及可能为临床治疗和预防肠道I/R损伤提供一种新的、安全和有效的治疗方法。
方法
分别在transwell系统上和六孔细胞培养皿内培养单层人类大肠粘膜上皮细胞Caco-2,应用0.5mMt-BuOOH诱导离体肠粘膜上皮细胞缺血/再灌注损伤,40个承有单层Caco-2细胞的嵌套膜系(培养孔)统随机分为五组(每组8例):对照组(N)、I/R组、高压氧预处理组(HBO-P)组、缺血期HBO干预组(HBO-I)和再灌注期HBO干预组(HBO-R)。采用跨膜电阻抗检测法(TEER)检测和评价肠道粘膜上皮细胞间紧密连接的开放程度。用RT-PCR检测细胞间紧密连接组成蛋白ZO-1转录水平,在TEER检测中设立空白transwell组以便比较(检测transwell嵌套系统本身的电阻值以下标记为BL-trans组)。
结果
检测TEER结果显示N组阻值最高,其次HBO-P组,再次HBO-R组,最后为HBO-I组。N组与其他各组差异显著(P＜0.01);HBO-P组阻值与I/R组、HBO-I及HBO-R组的阻值比较,差异显著(P＜0.05);HBO-R组与I/R组、HBO-I阻值比较,差异显著(P＜0.05);I/R组高于HBO-I组及BI-trans组,且差异显著(P＜0.05);BL-trans组与HBO-I组阻值无统计学差异(P＞0.05)。ZO-1mRNA的RT-PCR结果显示:与N组相比,I/R、HBO-P、HBO-R及HBO-I组ZO-1mRNA含量均有明显下降,且统计学差异显著(P＜0.01);HBO-P组ZO-1mRNA含量高于I/R、HBO-R及HBO-I,统计学差异显著(P＜0.01);HBO-R组ZO-1mRNA含量高于I/R和HBO-I组,且存在统计学差异(P＜0.05);HBO-I组与I/R组ZO-1mRNA含量接近,且不具备统计学差异(P＞0.05)。
结论
I/R损伤可导致单层Caco-2细胞TEER明显降低,通透性明显增加,ZO-1mRNA含量明显降低,TJ蛋白骨架ZO-1减少,提示细胞间TJ开放严重。高压氧干预显示出保护单层Caco-2细胞TJ功能作用,阻止TEER降低,抑制TJ开放,机制可能与增加细胞ATP、恢复有氧代谢,维持TJ的骨架蛋白ZO-1有关。缺血期前和再灌注期给予高压氧干预治疗显示有益结果,高压氧预处理效果更佳。缺血期给予高压氧使单层Caco-2细胞间TJ开放更明显,跨膜电阻抗阻值甚至低于I/R组,提示此期高压氧干预无效,甚至加重损伤。