中国石竹毛状根诱导、多倍体化及其植株再生

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为了探讨利用毛状根多态性来创新中国石竹的种质及改良其观赏性状的可能性,本文利用含野生农杆碱型Ri质粒的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)ATCC15834对花卉植物中国石竹(Dianthus chinensis L.)进行遗传转化、建立了其毛状根离体培养及其植株再生体系,并首次以石竹毛状根为诱变起始材料,通过化学诱变剂秋水仙素的人工多倍体化实验,获得了其毛状根多倍体及其再生植株。结果表明:发根农杆菌ATCC15834侵染石竹叶片外植体7d后,从叶片外植体的形态学下端产生白色不定根,所产生的毛状根较纤细,分支多,呈丛生状,培养至14d后外植体的生根率达100%,其生根频率(平均每个叶片外植体产生的不定根数目)为4。所产生的石竹毛状根能在无外源激素的MS液体和固体培养基中快速自主生长。经发根农杆菌rol基因的PCR扩增证实,发根农杆菌Ri质粒的rol基因己在石竹毛状根基因组中整合和表达。将石竹毛状根根尖转入愈伤组织诱导培养基培养14 d后,开始产生质地膨松的浅绿色愈伤组织;其愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+5.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA,其愈伤组织诱导分化率达100%;而愈伤组织转入不定芽分化培养基培养55 d后产生许多绿色芽点,67 d后绿色芽点逐渐发育成不定芽,而其愈伤组织不定芽分化的最适培养基为MS+0.9 mg/L6-BA+0.3 mg/L NAA,不仅愈伤组织不定芽分化率达100%,而且该培养基培养的毛状根愈伤组织在培养62 d后可出现试管内开花,直接分化产生大量花芽,且试管内开花频率为100%。所产生的不定芽增殖的最适培养基为MS+0.5 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA;而不定芽生根的最适培养基为MS+0.3 mg/L NAA+0.1%活性炭。盆栽试验表明,与非转化植株相比,中国石竹毛状根再生植株的植株矮化,其茎节缩短变粗,且不仅比对照平均提前24 d开花,而且所产生的花更大,花数目更多。  石竹毛状根秋水仙素多倍体诱导的实验结果表明,在供试的秋水仙素浓度中,以0.15%秋水仙素浸泡36 h诱导多倍体的效果最佳,其多倍体诱导率96%。根尖细胞的染色体数目观察表明,石竹非转化植株根尖以及二倍体毛状根再生植株的根尖细胞染色体数目为2n=2x=30,毛状根多倍体的根尖细胞染色体数目为4n=4x=60,表明所获得的多倍体为四倍体。取经倍性鉴定后的石竹多倍体毛状根根尖置于MS+5.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA培养基中培养30d,产生浅绿色的愈伤组织;将愈伤组织转入MS+0.9 mg/L6-BA+0.3 mg/L NAA培养70 d后,逐渐分化产生出不定芽并发育成石竹四倍体毛状根再生植株。多倍体植株叶片的气孔观察证实,与二倍体植株相比,四倍体植株的叶色更深,叶片较厚,其气孔明显比二倍体毛状根植株和非转化植株大,其保卫细胞叶绿体数目也较对照明显增多,但其气孔密度则比对照降低。  本文结果表明,利用发根农杆菌对中国石竹的遗传转化,不仅可获得花叶等观赏性状更优良以及可开花提早的毛状根再生植株,而且发现,可自主生长的石竹毛状根还可作为通过人工多倍体进行中国石竹倍性育种的诱变起始材料。所获得的结果为从多态性的毛状根再生植株及其多倍体毛状根再生植株筛选到观赏性更高,商业价值更大的中国石竹新品种,来进行其种质创新奠定了实验技术基础和可能性,也为其它花卉植物的种质改良和新品种创新提供了一条新的生物技术途径。
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