双光子荧光显微成像技术作为成像领域最重要的发明已经广泛应用于生物研究等各个领域。相比于共聚焦显微成像技术，双光子荧光产生的非线性本质使得双光子显微成像技术具有高信噪比、高分辨率、光漂白区域小等优点。此外，双光子显微成像技术使用的飞秒激光光源处于近红外波段，这一波段的光对生物样品的光损伤小、穿透能力强，因此双光子显微成像技术不仅适合于长时间的生物组织研究还有较大的成像深度。本文对双光子荧光显微成像理论进行了分析，自行搭建了一套双光子显微成像系统，设计编写了双光子荧光显微成像系统的控制软件，利用该系统进行了双光子荧光显微成像研究，并将其应用于生物领域。本文的研究工作主要从以下的几个方面进行。理论方面，对双光子荧光产生的过程进行了分析，推导了任意时间间隔内的双光子荧光强度的时间平均公式，通过公式证明了超短脉冲激光器用于双光子激励的优势。推导了双光子荧光的空间光强分布的公式，将其与单光子荧光效应的空间光强分布进行对比，分lq析了双光子荧光显微成像的优势。软件方面，设计编写了双光子荧光显微成像系统的控制成像软件，包括计算机控制模块、机械扫描模块、图像采集和处理模块。然后对影响机械扫描位置精度的因素进行了讨论，结果表明为了保证平移台的位置精度，设置系统的分辨率为1μm。最后讨论了单次采集与多次采集以及不同的像素时间间隔对成像结果的影响，结果表明，当选择多次采集并设置像素时间间隔在120-160ms之间时，成像结果不失真而且信噪比更高。实验上，首先利用飞秒激光作为光源对不同浓度的Rhodamine B溶液的双光子荧光光谱进行测量，结果表明随着溶液浓度的增加，双光子荧光光谱中心波长逐渐增加并向其最大荧光发射波长610nm处靠近。然后利用自行搭建的双光子荧光显微成像系统对Rhodamine B样品进行了双光子荧光显微成像和透射成像研究，其成像结果的对应性证明了该系统成像的正确性，并通过对不同层面Rhodamine B样品的扫描得到了Rhodamine B样品的三维图像。最后，利用该成像系统对生物细胞进行了双光子荧光显微成像，对染有DAPI和RhodamineB的Hela细胞进行双光子荧光显微成像和透射成像，验证了DAPI染料的核定位能力和Rhodamine B染料的细胞染色能力，分析了平移台z轴位置对成像结果的影响以及入射激光功率与发射荧光的强度的关系。