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基于当前小鹅瘟亚单位蛋白疫苗的研究尚属空白，本文通过对小鹅瘟病毒衣壳蛋白VP3基因的生物信息学分析，设计并制备了源于VP3基因重要抗原表位区域的两个基因工程重组亚单位疫苗(Ag16v和Ag10v)，并将该疫苗应用于对青年鹅和种鹅的免疫原性研究。具体结果如下：
1.小鹅瘟病毒VP3基因抗原表位分析进行生物信息学分析及其16个抗原决定簇片段(Ag16)和10个抗原决定簇片段(Ag10)的扩增、克隆
生物信息学分析预测VP3基因可能存在两个主要抗原表位，即16个抗原决定簇(位于106-1422bp)和10个抗原决定簇(位于106-774bp)，分别命名为Ag16和Ag10，经PCR扩增后成功克隆于pMD-18-T，获得pMD-18-T-Ag16和pMD-18-T-Ag10，经酶切和测序鉴定正确。
2.小鹅瘟病毒VP3基因Ag16和Ag10抗原决定簇片段的原核表达和产物纯化
pMD-18-T-Ag16和pMD-18-T-Ag10与pET-32a(+)连接后分别获得原核表达载体pET-32a(+)-Ag16和pET-32(+)-Ag10，转化。Rosseta(DE3)后可高效表达，Westernblotting证实表达产物可被兔抗GPV血清有效识别，具有良好免疫反应性。表达蛋白以包涵体形式存在，经包涵体洗涤和镍柱纯化后获得高纯度重组蛋白Ag16和Ag10。
3.小鹅瘟病毒VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag16v和Ag10v对青年鹅免疫原性研究
将获得的纯化重组蛋白Ag16和Ag10分别与等体积完全弗氏佐剂混合，乳化成终浓度为1mg/mL的基因工程重组亚单位疫苗Ag16v和Ag10v。将80只28日龄鹅平均分成8组，编号A、B、C、D、E、F、G、H，将Ag16v以0.125mg/只，0.25mg/只，0.5mg/只分别皮下免疫到A、B、c组青年鹅；将Ag10v以0.125mg/只，0.25mg/只，0.5mg/只分别皮下免疫到D、E、F组青年鹅；并设立1羽份/只的弱毒免疫对照G组和0.5ml0.02MPBS/只皮下免疫对照组H组。于免疫后3d，7d，14d，21d，35d，49d，63d，77d，91d，105d，119d，133d，147d，161d，175d采血，3-49d采血做MTT淋巴细胞转化试验，3-175d做间接ELISA法测定血清IgG抗体滴度和中和抗体实验。MTT结果显示，不同免疫剂量的Ag16v和Ag10v均能有效的刺激机体产生细胞免疫应答，显著(P＜0.05)高于PBS对照组，但低于(P＜0.05，P＜0.01)弱毒对照组。ELISA检测IgG抗体的OD450值结果发现，不同免疫剂量的Ag16v和Ag10v均能刺激青年鹅机体产生体液免疫应答，于28d时其OD450值达到峰值，极显著(P＜0.01)高于PBS对照组，但弱毒对照组的青年鹅于35d时达到峰值，其峰值与两基因工程重组亚单位疫苗峰值基本相当。中和抗体试验测定结果显示，Ag16v和Ag10v均能有效的刺激青年鹅机体产生高效价的中和抗体，于7d开始检出中和抗体，至35d时其中和抗体达到峰值，而PBS对照组未检出其血清中有中和抗体，弱毒免疫的对照组青年鹅血清中和抗体峰值出现于49d，峰值大小与Ag16v、Ag10v免疫组峰值基本相当。从免疫效果(包括MTT、ELISAOD值、中和抗体效价)与免疫剂量的关系分析，Ag16v和Ag10v各免疫组均表现为，高剂量组高于中剂量组，中剂量组高于低剂量组，说明Ag16v和Ag10v的免疫效果存在剂量相关性。将同等剂量的Ag16v和Ag10v刺激青年鹅机体产生的免疫效果进行比较发现，Ag10v免疫组在大多时间点上，显著或极显著(P＜0.05，P＜0.01)高于Ag16v免疫组，这可能与单位质量的抗原蛋白内，Ag10v含抗原决定簇数目较Ag16v更高有关，同时也提示我们，在选择基因工程重组亚单位疫苗的抗原时，有必要考虑该段蛋白的大小和抗原决定簇密度的关系，从而设计出更为合理、更高效率的亚单位疫苗。
4.小鹅瘟病毒VP3基因工程重组亚单位疫苗Ag16v和Ag10v对种鹅免疫原性研究
取初产种母鹅200只，平均分成4组，编号A、B、C、D，取种公鹅50只平均分配到4组混养。将Ag16v以0.5mg/只皮下免疫A组种鹅，Ag10v以0.5mg/只皮下免疫D组种鹅，弱毒1羽份/只皮下免疫B组种鹅，0.02MPBS0.5ml/只皮下免疫C组种鹅。于免疫后3d、7d、14d、21d、28d、35d、49d、63d、77d、91d、105d、119d、133d、147d、161d、175d随机每组采血10只测定血清IgG和中和抗体，并取种蛋，每组随机取5枚用于卵黄抗体EIASA测定和中和抗体测定，其余孵化成雏鹅，而后随机每次每组取10只于1日龄口服小鹅瘟强毒，记录死亡情况，并于7日龄全部安乐处死，取肝、十二指肠、直肠做切片镜检，统计保护率。ELISA测定OD450值结果显示，Ag16v和Ag10v免疫的种鹅血清IgG抗体OD450值大幅上升，28d达峰值，175d仍维持较高水平，所产种蛋均含有较高的IgG抗体，至35d达到峰值，显著高于对照PBS组，弱毒免疫组的种鹅所产种蛋也含有较高的IgG抗体，且至49d时达到峰值，与Ag16v和Ag10v峰值大小相当。中和抗体测定试验结果显示，Ag16v和Ag10v免疫的种鹅于免疫后7d检出血清中和抗体，35d升至最高，175d仍维持较高水平，在免疫14d后开始检出卵黄中和抗体，并于35d达到峰值，而弱毒免疫组的种鹅的峰值出现在49d，其大小与Ag16v相当，极显著(P＜0.01)低于Ag10v，PBS免疫组种鹅所产种蛋未检出中和抗体。攻毒试验结果显示，Ag10v免疫的种鹅21d后其后代开始出现90％较高保护率，而Ag16v、Ag10v和弱毒免疫种鹅28d后首次出现100％的保护率，Ag16v组和Ag10v组的100％保护率一直持续到种鹅免疫后的147d，弱毒组的100％保护率持续到种鹅免疫后的161d，PBS免疫的种鹅后各时间点的后代未检测到保护率。
通过对青年鹅和种鹅的免疫效果评价结果表明，本研究所研制的两基因工程重组亚单位疫苗Ag16v和Ag10v均具有良好的免疫原性。在青年鹅体的试验中表明，Ag16v和Ag10v产生的细胞免疫应答效果显著的低于弱毒疫苗，但在体液免疫应答、中和抗体效价方面，Ag16v略低于弱毒，而Ag10v高于弱毒，推测这可能与Ag10v抗原决定簇较Ag16v更为集中有关，同时，不同剂量的Ag16v和Ag10v免疫结果显示，两疫苗的免疫效果均存在一定的剂量相关性。采取青年鹅体试验的最佳免疫剂量0.5mg/只将两疫苗免疫种鹅结果表明，Ag16v和Ag10v免疫的种鹅血清及所产种蛋均有高水平的卵黄抗体IgG和中和抗体，并能为雏鹅提供近5个月对小鹅瘟强毒100％的保护力，这一结果与对照弱毒的免疫结果相当。Ag16v和Ag10v较弱毒具有无潜在危险、方便运输等优势，因此，其比弱毒疫苗具有更强的应用前景。