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乳腺癌是一种女性常见的恶性疾病,其发病率高,侵袭性强,同时具有病程进展缓慢,自然生存期长等特点。近年来,随着手术、放疗、化疗、内分泌治疗、分子靶向治疗以及中医中药等各种治疗方法的不断发展,乳腺癌患者的存活率有了一定程度的提高,综合治疗已成为治疗乳腺癌的主要治疗手段。本实验室前期研究发现,新藤黄酸可通过多通路多靶点抑制肿瘤细胞的增殖;本课题则在此基础上,联合乳腺癌临床一线用药阿霉素,以增效减毒为目的;研究新藤黄酸与阿霉素单独及联合用药时对乳腺癌细胞株MCF-7细胞凋亡率的影响,并进一步研究两药联用的可能机制,为将新藤黄酸开发成为临床有效的抗肿瘤药物提供一定的理论依据。目的:研究新藤黄酸与阿霉素联合应用对人乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响,并进一步探讨其相关机制。方法:体外培养人乳腺癌细胞MCF-7细胞株,采用MTT法检测新藤黄酸与阿霉素单独及联合处理后细胞的存活率,倒置显微镜观察细胞形态;Chou-Talalay联合指数法评价新藤黄酸与阿霉素的药物联合作用;DAPI细胞核染色实验荧光显微镜下观察新藤黄酸与阿霉素单独与联合作用对MCF-7细胞形态变化的影响;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测给药后MCF-7细胞凋亡率;流式细胞仪检测JC-1染色细胞线粒体膜电位的变化;Western blot法分别检测新藤黄酸与阿霉素单独及联合处理MCF-7细胞后ASK-1、p-ASK-1、JNK、p-JNK、Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3通路蛋白表达的变化,同时检测经JNK通路抑制剂SP600125处理后相关蛋白指标的变化。结果:(1)MTT检测结果显示,在一定浓度范围内,人乳腺癌细胞MCF-7的细胞存活率随着新藤黄酸(0.125-4μmol/L)与阿霉素(0.5-16μmol/L)给药剂量的增加而降低,且联合用药组细胞存活率低于单独用药组。联合指数法分析计算后得出合用指数CI<1,提示两药联合具有协同作用。(2)倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞形态变化发现,与对照组相比,给药组MCF-7细胞明显缩圆变小,DAPI染色后细胞核破碎,呈现凋亡特征;而联合用药组凋亡细胞数明显高于单独用药组。(3)AV/PI双染经流式细胞仪检测后发现,新藤黄酸与阿霉素单独和联合作用均能诱导MCF-7细胞凋亡,且联合用药组细胞凋亡率与单独用药组相比显著增加(p<0.01)。(4)JC-1染色结果显示单独给药组的MCF-7细胞线粒体膜电位有所降低,而联合用药组与单独给药组相比则膜电位明显降低。(5)Western blot法实验结果表明,与对照组比较,单独给药组中ASK-1、p-ASK-1、JNK、p-JNK、Cyt-c、Caspase-9和Caspase-3蛋白均被激活,相关蛋白表达量增加,而联合用药组蛋白表达显著上调(p<0.01)。(6)使用JNK通路抑制剂SP600125处理后,Western blot结果显示,ASK-1和p-ASK-1蛋白表达与未处理组无明显差异,Cyt-c和Caspase-9蛋白表达量略微下降,Caspase-3蛋白表达无显著变化,而SP600125抑制了JNK,p-JNK蛋白表达上调,且联合用药组蛋白表达与单独给药组相比有所降低。结论:新藤黄酸与阿霉素单独和联合应用均能诱导人乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡,且两者联合应用可产生协同效应,其作用机制可能与调控JNK信号通路相关。