研究背景细胞增殖是生物体的重要生命特征。细胞以分裂的方式进行增殖,用来补充体内衰老和死亡的细胞。细胞增殖是指细胞在周期调控因子的作用下通过DNA复制、RNA转录和蛋白质合成等复杂反应而进行分裂的一系列过程。细胞增殖检测技术广泛应用于分子生物学、遗传学、肿瘤生物学、免疫学、药理和药代动力学等研究领域。目前,检测细胞增殖的技术主要包括：(1)渗透实验。这种方法用来染细胞膜破损的细胞,活细胞不会被台盼蓝染成蓝色。然后通过细胞计数器手动计数细胞数目。此方法快速、便宜、仅仅需要一少部分细胞。细胞传代、冻存、或其它实验可以用这种方法。或者也可以通过流式细胞仪来计数细胞数目。检测前可以染PI排除死细胞。(2)直接增殖测定。这种方法利用DNA整合来测定细胞增殖。此方法利用整合到DNA中的放射性或非放射性的核酸类似物来检测。比如：Brdu免疫化学染色法需要将细胞或组织标本经过变性处理,这就影响了标本的结构,使标本不适合下游实验,也使得染色结果及程度过分地依赖于不同实验所应用的不同条件。(3)细胞代谢法。这种方法是将四唑盐加入细胞培养基内,这些四唑盐可以被活细胞转化为有颜色的甲瓒,用酶联免疫分析仪测定其光吸收值可间接反映活细胞数量。此方法已广泛用于各种细胞增殖的检测,生物活性因子的活性检测,大规模的抗肿瘤药物筛选,细胞毒性试验等。常用荧光染料DAPI可染色细胞核,但一般用来染死细胞。有研究利用细胞膜荧光染料PKH26对肿瘤细胞染色后,根据肿瘤细胞PKH-Pos和PKH-Neg或PKHhigh和PKHlow来分离恶性肿瘤干细胞,但是这种定性检测不能定量分析出细胞分裂次数。PKH26染细胞时需要经过多次洗涤细胞的过程及加入不同的试剂,因此染色比较复杂和费时。而且,它虽然可以用来在体内外对细胞进行示踪,但是,不能用来做冰冻切片和特殊的爬片技术。荧光染料CFSE可以对组织及淋巴器官中的淋巴细胞进行示踪及定位。有研究用CFSE检测人和鼠体内外检测淋巴细胞增殖,CFSE稳定地标记细胞内的分子,细胞每分裂一次,荧光强度减半。通常,淋巴细胞标记CFSE后,其分裂8次后流式仍然可以检测到。因细胞分裂次数不同淋巴细胞分化程度就不同,通过带有不同荧光染料的抗体用流式细胞技术检测不同的细胞表面分子、胞内蛋白及细胞因子。进而,利用合适的细胞表面标志物可以在一群复杂的细胞中对特定的淋巴细胞亚群和细胞分裂次数同时进行量化。在利用CFSE标记细胞时,要特别注意表型分析过程中荧光的选择以避免光谱的重叠。降低CFSE染细胞时的浓度将会减少检测时调节补偿的问题,但同时也限制了我们可以观察到的细胞分裂次数。细胞膜荧光染料DiO染活细胞后可以直接用流式细胞仪的定量测定荧光强度,而且荧光衰减很慢,有研究表明染色组织常温保存2年后仍可观察到荧光。因此,本课题在同一群肿瘤细胞中定量测定了各亚群细胞分裂次数,同时保持细胞完整性,可继续进行细胞功能的测定,也可提取细胞蛋白和RNA进行测定。有研究指出APOBEC3G,、CD133、 LIPC和S100P在功能上调节大肠癌的肝转移,其阳性预示着大肠癌存在肝转移。另一项研究显示非小细胞肺癌中LIPC表达水平可能具有一个独立的预后价值。因此,本实验利用这种新的DiO染色方法研究了LIPC在肿瘤细胞耐药中的机制。主要方法及结果1DiO的研究1.1DiO和DiD同属亲脂性羰花青染料。它们是由两个对称的环,每个环连接一个长的碳氢链,环中间由奇数个次甲基连接构成。双环结构及连接双环的次甲基数目的不同决定了荧光分子的特性。碳氢链的长短决定了它们与膜脂质双层结构的亲疏性。DiO的最大吸收和释放波长分别是484nm和501nnm,DiD的最大吸收和释放波长分别是644nm和665nm。1.2MTT测定DiO染色后细胞的增值情况。结果显示DiO染色后Lovo、 SW480、 SW620、 CT26、 HepG2细胞在1、2、3天不影响其增殖P>0.05。1.3将DiO染色后的HEPG2细胞与没有染色的CT26细胞1：1混合培养一周,然后用抗人EPCAM抗体染色,由于EPCAM是抗人抗体,HepG2强表达人EPCAM,而小鼠细胞CT26不表达人的EPCAM.流式结果显示在EPCAM阴性细胞中很少有DiO阳性细胞。此实验证明DiO在体外培养的细胞间很少互相转移(8%±0.096%)。1.4将DiD染色后的HEPG2细胞注射到小鼠皮下,当有明显的肿瘤形成时,取下皮下瘤,用抗人EPCAM抗体染色,同样我们观察到在EPCAM阴性细胞中很少有DiD阳性细胞(4.5%±0.08%)。证明DiD在体内细胞间很少互相转移。1.5设M为平均荧光强度,N细胞数目,S表示细胞分裂次数。假定DiO荧光没有衰减,并且细胞每分裂一次,荧光平均分配到两个子代细胞中。那么可以推出M初*N初=M末*N末,log2M初/M末=S=log2N末/N初,即S=log2M初-log2m末,因为初始荧光强度是一定的,因此S和M末可进行对数曲线拟合获得细胞分裂标准曲线。我们用DiO染色细胞后,平均铺于六孔板中,用不同的血清浓度的培养基培养,以控制其处于不同的生长速度。一周后消化每孔细胞,计数每孔细胞数目,检测每孔细胞平均荧光强度。用R软件得到对数拟合公式,并且用excel做出对数拟合曲线。结果显示,Lovo、 SW480、CT26、 HepG2、SW620的拟合公式分别为S=-1.7930810g2M末+16.41884,S=-2.615610g2M末+16.37847,S=-2.774491og2M末+29.27126,S=-1.4299log2M末+18.82296,S=-1.715331og2M末+13.34059.R2分别为0.7871,0.8867,0.9044,0.9033和0.9853。由此得出测定荧光强度可以定量测定活细胞亚群的分裂次数。1.6将DiO染色的Lovo和HepG2细胞N1个置于六孔板培养,当细胞生长到80-90%时收集4/5细胞,计数这部分细胞数目,计为N,并且测定其荧光强度M。剩下的1/5细胞继续培养。当细胞生长再次生长到80-90%,重复上述步骤,直到平均荧光强度接近自发荧光强度时结束本实验。然后计算出从细胞染色后假设细胞不进行收集和流式测定而一直培养到每次收集时间点时的细胞总数目Nn=(5N/4)×5n-1(n为收集细胞的次数)。细胞分裂次数S=log2Nn/N1。最后用R软件得到末期荧光强度和分裂次数的对数拟合公式,并且用excel做出对数拟合曲线。Lovo和HepG2的拟合公式分别为S=-1.28089log2M末+14.00148,S=-1.08121og2M末+11.56886(由于每次染色时的M初不同,因此得到的公式与1.3有差异)。R2值分别为0.99、0.99。表明DiO在一定时间内荧光强度的衰减不影响对细胞分裂次数的分析。2DiO体内及体外应用2.1将DiO染色后的HEPG2细胞用阿霉素化疗一周后,用人CD133抗体行流式检测,发现化疗后细胞增殖显著减慢,CD133百分比显著降低(p<0.05)。并且发现细胞在化疗后分成了DiO荧光强度明显不同的两群细胞,进一步对比不同化疗组两群细胞间CD133的表达情况,发现DiO荧光强度低的这群细胞中CD133百分比降低更明显。因此,我们推断,CD133+细胞对化疗更敏感。2.2将DiO染色后CT26注射小鼠皮下,分别在3、9、14天取小鼠皮下瘤,测定其DiO荧光强度。2.3将DiO染色后CT26分别注射小鼠皮下和脾被膜,3天后分离皮下瘤、脾脏瘤以及肝脏,流式检测肿瘤细胞荧光强度。脾脏和肝脏内CT26细胞的荧光强度显著低于皮下CT26细胞的荧光强度,脾脏内CT26分裂速度大约是皮下的7倍,说明CT在不同组织中分裂速度差异显著。肝脏转移瘤细胞的荧光强度低于脾脏,似乎可以推断分裂快的细胞更容易发生器官间的转移。2.4为了排除是由于在不同器官内CT26分裂速度本身就不同,我们用DiO染CT26三天后注射小鼠肝被膜,在3、4、5、9、10天处死不同小鼠,分别分离其肿瘤注射部位肝叶,其余肝叶(转移瘤)。测定肿瘤细胞平均荧光强度。我们发现转移肿瘤的荧光强度显著低于注射部位肿瘤荧光强度,进一步证实在同一个器官中分裂快的CT26细胞容易转移。3细胞化疗耐药中LIPC的作用3.1肿瘤细胞株LIPC的表达不同细胞株中脂肪酶生物活性的检测,发现HepG2脂肪酶活性最高。PCR及Western Blot检测不同细胞株中LIPC的表达,发现HepG2mRNA及蛋白质表达水平最高。因此,我们选择HepG2来进行表达敲低研究。3.2构建稳定表达LIPC shRNA的HepG2细胞株慢病毒感染HepG2后培养48-72h后,荧光显微镜下观察细胞荧光,并且流式细胞检测EGFP绿色荧光阳性细胞数,阳性率均大于90%.Western Blot检测敲低LIPC后蛋白质水平的表达明显下降(p<0.05)。3.3MTT增殖实验MTT增殖实验检测HepG2shCON和HepG2shLIPC的增殖情况,结果显示shLIPC组的增殖显著减慢(p<0.05)。3.4三维基质胶培养测定克隆形成三维基质胶培养检测HepG2shCON和HepG2shLIPC两组间克隆形成率,结果显示shLIPC组克隆形成明显减少。3.5阿霉素和5-FU化疗后测定其增殖情况HepG2shCON和HepG2shLIPC两组中分别加入0.03、0.1、0.3uM阿霉素或者0.2uMm、2uM5-FU,发现HepG2shLIPC组增殖显著减慢(p<0.05)。说明下调LIPC后,出现化疗抵抗。3.6CD133染色后流式测定消化对数生长期的HepG2shCON和HepG2shLIPC细胞,流式检测CD133在细胞膜上的表达,发现HepG2shLIPC组CD133+细胞百分比显著降低(p<0.05)。进一步给细胞膜固定打孔后流式检测细胞内CD133含量时,同样发现HepG2shLIPC组CD133+细胞百分比显著降低(p<0.05)。统计分析使用SPSS13.0统计软件。两组间比较采用t检验,不同浓度化疗药物加入细胞增殖实验采用双因素方差分析,多组间比较采用SNK法。结论1肿瘤细胞DiO染色后不影响细胞增殖；DiO染肿瘤细胞后,在体外培养中,细胞与细胞之间荧光染料很少相互转移；DiO染肿瘤细胞后,体内种植生长8天,细胞与细胞之间荧光染料很少相互转移。2肿瘤细胞DiO染色后测定荧光强度可定量检测细胞分裂次数,并且DiO染肿瘤细胞后在12天内荧光强度的衰减不影响对细胞分裂次数的定量分析。3DiO染肿瘤细胞后体外化疗实验中,CD133阳性细胞对化疗更敏感；DiO染肿瘤细胞后注射到小鼠体内,分裂快的肿瘤细胞更容易转移。4HepG2细胞下调LIPC后,细胞增殖减慢,细胞克隆形成率减低,细胞对化疗产生抵抗,CD133表达下降,增殖减慢,但对化疗更耐药；CD133+细胞增殖快,促进肿瘤体内外生长。