分子影像学是采用影像学技术无创性地对活体内参与生理或病理过程的分子进行可视化检测，活体状态下对分子、基因和细胞的变化进行定性和定量研究的一门科学。磁共振成像(MRI)、活体光学成像及核素显像是该领域的三大主体技术。核素显像有一定的辐射损伤，观察时间有限，应用受限。MRI和活体光学成像，尤其是近年来发展迅速的近红外荧光(NIRF)成像更为安全，在疾病的早期诊断和靶向治疗、干细胞的标记与活体示踪等方面应用越来越广泛。MRI具有时间和空间分辨率高、解剖定位准确的优势，而敏感性相对不足，光学成像虽穿透深度有限，空间定位较差，但却具实时成像、敏感性高等优点。多模态成像策略，即多种成像模式的结合与优势互补，可解决单一技术的缺陷，是分子影像学未来的发展方向。制备安全性高、生物相容性好的多功能纳米材料及靶向性能高的分子探针是实现活体多模态成像的有力手段之一，也是目前分子影像学的研究热点。　　 第一章磁性-荧光量子点双功能纳米粒子双标记rMSCs　　 目的：　　 制备磁性-荧光量子点双功能纳米粒子，一步双标记大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)，评价双功能纳米粒子对rMSCs的标记效率、可行性和安全性，探讨其用于MRI和光学多模态成像的应用价值。　　 方法：　　 1.利用二氧化硅(SiO2)同时包裹四氧化三铁(Fe3O4)和碲化镉(CdTe)，制备磁性-荧光量子点双功能纳米粒子Fe3O4@CdTe@SiO2。　　 2.使用透射电镜、振动磁强计和紫外激发灯等对纳米粒子的粒径、分布、饱和磁化强度和荧光性能等进行表征。　　 3.通过密度梯度离心+贴壁法获取rMSCs，体外传代、培养，并通过慢病毒感染将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因转导入rMSCs基因组，使其持续稳定表达EGFP。　　 4.利用铁浓度为25μg/mL的Fe3O4@CdTe@SiO2与rMSCs共同孵育，通过荧光显微镜和普鲁士蓝染色观察细胞内双功能纳米粒子，检测双标记效率，分光光度计测量细胞铁含量。以未标记的rMSCs作为对照。　　 5.采用CCK-8法检测细胞毒性和增殖能力，台盼蓝拒染测细胞活力，成骨、成脂诱导检测细胞多向分化能力，评价双标记对rMSCs生物学特性的影响。荧光显微镜和普鲁士蓝染色观察诱导分化后Fe3O4@CdTe@SiO2双标记情况。　　 6.双标记后的rMSCs分成不同数量级(3×106-1×103个)，使用临床1.5T MR扫描仪进行SE T1WI、FSE T2WI和GRE T2*WI成像，测量T2WI和T2*WI不同数量级细胞的信噪比(SNR)，观察细胞数量与MRI信号变化的关系。　　 结论：　　 1.壳核结构的Fe3O4@CdTe@SiO2纳米粒子具有超顺磁性和荧光双重特性，可同时对rMSCs进行磁性和荧光双标记，标记效率高，持续时间长，细胞毒性低，对rMSCs的生物学特性无明显影响，在体外诱导分化过程中细胞内纳米粒子的荧光和超顺磁性仍可持续3周以上。　　 2.1.5TMR扫描仪可检测到Fe3O4@CdTe@SiO2双标记后细胞的信号变化程度与数量级间存在相关性，有望为MRI和光学多模态成像示踪移植后rMSCs提供技术基础。　　 第二章磁性-近红外双功能探针的构建及HeLa细胞和hMSCs体外多模态靶向成像　　 目的：　　 构建人转铁蛋白(Tf)介导的磁性-近红外荧光(NIRF)双功能分子探针，靶向标记高表达hTfR的肿瘤细胞(HeLa)和人骨髓间充质干细胞(hMSCs)，探讨MRI和NIRF多模态hTfR靶向成像及对hMSCs靶向示踪的可行性。　　 方法：　　 1.将Tf与NIRF染料cy5.5通过羧氨反应结合，制备Tf-cy5.5，在EDC/sulfo-NHS的催化下，进一步与超顺磁性的氧化铁(IO)相连接，构建磁性-NIRF双功能分子探针Tf-cy5.5-IO。以人血清白蛋白(HSA)作为对照蛋白，构建对照粒子HSA-cy5.5-IO。　　 2.通过琼脂糖凝胶电泳、蛋白-核酸分析仪全波长扫描吸收谱分析、粒度与Zeta电位分析仪以及透射电镜等确定Tf-cy5.5-IO连接效率，对其粒径、分布与Zeta电位等理化特性进行表征。　　 3.通过慢病毒感染将人源化绿色荧光蛋白(hrGFP)基因转导入hMSCs，使其持续稳定表达hrGFP。Balb/c裸鼠皮下注射5×106个慢病毒感染后的hMSCs，观察其致瘤性，以等量HeLa皮下注射作为对照。　　 4.将表达hTfR的HeLa细胞和hMSCs分为4组，即A、未标记细胞组；B、靶向探针组；C、HSA对照组和D、竞争实验组，对各组细胞进行激光共聚焦扫描、普鲁士蓝染色、细胞铁含量测定及流式细胞仪检测，验证Tf-cy5.5-IO对hTfR的靶向性。　　 5.取各组2×105个HeLa细胞和hMSCs，进行体外细胞MRI和NIRF成像，定量检测R2值和平均荧光强度值的变化率，评价Tf-cy5.5-IO用于HeLa和hMSCs靶向多模态成像的可行性。　　 6.采用CCK-8法检测Tf-cy5.5-IO对两种细胞的细胞毒性及对hMSCs增殖能力的影响，台盼蓝拒染法测细胞活力，碘化吡啶法测细胞凋亡和周期，对hMSCs进行成骨、成脂和成软骨诱导检测细胞多向分化能力，评价双功能探针对靶细胞生物学特性的影响。　　 7.将探针标记后的第5代hMSCs、成骨和成脂诱导后的hMSCs分别分为上述4组，进行MRI和NIRF成像，验证Tf-cy5.5-IO对标记或分化后hMSCs的靶向性。　　 8.Balb/c小鼠尾静脉注射Tf-cy5.5-IO后连续饲养10d，对小鼠进行一般情况观察、肝肾功能测定和病理学检查，评价探针对活体小动物的急性毒性作用。　　 结论：　　 1.Tf-cy5.5-IO分子探针具有磁性和NIRF双重特性，能够特异性识别hTfR靶分子，通过MRI和NIRF成像可实现对高表达hTfR的HeLa细胞和hMSCs体外多模态靶向成像。　　 2.探针的细胞毒性低，对肿瘤细胞和干细胞生物学特性未产生负面影响，小鼠活体内应用显示双功能探针的生物相容性好，无明显急性毒性作用。　　 3.在体外，利用Tf-cy5.5-IO双功能探针，能够对hMSCs进行靶向成像，探针对标记后第5代和诱导分化后的hMSCs仍具有靶向性。　　 第三章hTfR体外多模态成像及QPCR对照研究　　 目的：　　 对不同hTfR表达水平的细胞进行MRI-NIRF多模态成像，与荧光实时定量PCR(QPCR)检测所得hTfR靶基因表达情况进行对照研究，客观评价Tf-cy5.5-IO探针靶向hTfR成像灵敏度。　　 方法：　　 1.收集HeLa、hMSCs、U251和HepG2四种细胞，提取基因组RNA，通过QPCR检测hTfR基因表达的相对水平。　　 2.Tf-cy5.5-IO探针与四种细胞以相同浓度共同孵育1h后，流式细胞仪检测细胞cy5.5的平均荧光强度，每种细胞均设未标记细胞组和等量HSA-cy5.5-IO对照粒子组作为对照。　　 2.等量Tf-cy5.5-IO与四种细胞共同孵育4h后进行细胞的MRI和NIRF成像，定量检测其R2值和平均荧光强度值的变化率，与QPCR结果对照分析。　　 结论：　　 1.Tf-cy5.5-IO分子探针与hTfR结合进行MRI-NIRF靶向成像，在一定程度上可定量反映细胞hTfR基因的表达水平。　　 2.hMSCs相对高表达hTfR，且MRI-NIRF多模态靶向成像具有可视性和定量检测能力，为进一步开展hMSCs靶向活体示踪研究提供了思路。