研究背景急性心肌梗死是一种危害生命的严重疾病,如何快速开通犯罪血管,恢复心肌血供,拯救濒临坏死的心肌,是治疗的基本原则。近年来,围绕着心肌再灌注治疗,静脉溶栓术、经皮冠状动脉腔内成形术、冠状动脉搭桥术等手段广泛的应用于临床,并取得了很好的疗效。但缺血心肌在恢复血流灌注后,会出现一些严重甚至致命的损伤,称为心肌缺血再灌注损伤。实现心肌微循环再灌注,即开通犯罪血管的基础上,实现心肌组织的正常灌注,是减轻心肌缺血再灌注损伤,治疗急性心肌梗死的最佳手段。因此,深入研究再灌注损伤的发生机制,是合理治疗急性心肌梗死的基础。心肌缺血再灌注损伤发病机制主要包括：线粒体功能障碍,活性氧的生成,钙离子超载等。其中细胞内钙超载是造成缺血再灌注心肌细胞不可逆损伤的终末环节。如何改善再灌注时机,防治细胞内钙超载是治疗缺血再灌注损伤的关键。迄今为止,有关缺血再灌注过程中细胞内钙超载的机制尚未完全明确,临床实践中缺乏有效手段防治细胞内钙超载及相关损伤。Wnt/frizzled信号通路被认为是多种心血管疾病的调控靶点。现已证实心肌梗死后发生的一系列病理过程中,伴有Wnt/frizzled的通路激活。在Wnt家族中,Wnt5a/frizzled-2被认为与细胞内钙离子代谢关系密切,它的激活可通过Wnt/Ca2+;途径途径触发细胞内钙离子释放,并激活蛋白激酶C和Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ等Ca2+敏感性酶。导师团队前期的研究中发现：wnt5a/frizzled-2能在哺乳动物大鼠及其细胞株H9C2中稳定表达,在生理条件下,wnt5a及frizzled-2的表达呈低水平状态；将包含合成frizzled-2全基因的质粒转染至正常的H9C2细胞,转染后细胞中Wnt5a和Frizzled-2无论在基因还是蛋白水平上都显著提高,且转染后细胞内钙离子浓度显著升高。我们还发现,在体内及体外环境下,缺血再灌注损伤能上调frizzled-2及wnt5a基因及蛋白水平表达,通过Stealth RNAi的方法预处理缺氧/复氧细胞,干扰frizzled-2的基因表达,可显著下调缺氧/复氧细胞frizzled-2及wnt5a基因和蛋白的表达水平,同时显著降低细胞内钙离子浓度。我们的前期研究表明：Wnt5a/FriZZled-2通路的激活是缺氧/复氧心肌细胞内钙超载的潜在机制之一。白黎芦醇是一种有天然抗氧化作用的多酚类化合物。近年来,其心血管保护作用引起了越来越多的关注。一般认为,白藜芦醇通过预适应效应发挥心血管保护作用,而对其后适应效应的研究较少。此外,白藜芦醇的剂量与心血管保护效应之间的关系,尚存在争议。以往研究表明,白藜芦醇预处理减轻H2O2所诱导的乳鼠心肌细胞钙离子超载,并抑制细胞的损伤及凋亡,但具体机制未见报道。因此,本实验采用体外的缺血再灌注模型,在细胞水平模拟心肌缺血再灌注损伤,来观察白藜芦醇后处理对缺氧/复氧心肌细胞钙超载的影响,并探讨其潜在机制。目的综合上述分析,本研究拟从细胞水平上探讨：1.建立体外H9C2心肌细胞缺氧/复氧模型以模拟体内缺血再灌注损伤,从细胞水平探讨不同浓度的白藜芦醇后处理对缺氧/复氧心肌细胞缺氧钙离子超载以及细胞损伤、凋亡的影响。2.建立体外H9C2心肌细胞缺氧/复氧模型,在细胞水平上研究白藜芦醇对缺氧/复氧心肌细胞钙离子超载的保护效应的潜在机制。3.对细胞信号通路进行干预的同时,予白藜芦醇处理细胞,观察白藜芦醇对细胞信号通路表达及胞浆内钙离子浓度的影响,进一步探讨白藜芦醇对心肌细胞钙离子超载的作用机制,为细胞内钙超载的防治提供新的策略。对象与方法第一部分实验：我们首先培养了大鼠心肌H9C2细胞,建立体外细胞缺氧复氧模型,实验分为5组：正常对照组,缺氧/复氧组,缺氧/复氧细胞加不同浓度白藜芦醇(5umol/l,25umol/l,100umol/l)后处理组,分别用倒置显微镜下观察各组细胞生长状态,Fluo-3孵育细胞后,用激光共聚焦显微镜检测各组细胞胞浆内钙离子荧光强度,通过CCK-8法检测细胞活性,检测培养液中LDH活性评估细胞损伤情况,通过流式细胞仪检测细胞凋亡率,凋亡蛋白酶-3检测试剂盒观察凋亡蛋白酶-3活性。第二部分实验：离体培养大鼠心肌H9C2细胞,建立细胞缺氧/复氧模型,实验分为5组：正常对照组,缺氧/复氧组,缺氧/复氧细胞加不同浓度白藜芦醇(5umol/l,25umol/l,100umol/l)后处理组,通过实时定量聚合酶链反应分别检测各组细胞Frizzled-2及Wnt5a的基因表达水平；通过免疫印迹法分别检测各组细胞Frizzled-2及Wnt5a的蛋白表达水平。第三部分实验：首先合成Frizzled-2基因,以pEGFP-C1为载体,构建pEGFP-C1-Frizzled-2质粒,将pEGFP-C1-Frizzled-2质粒结合Lipo2000转染至H9C2细胞。并将实验细胞分为3组：正常对照组,转染细胞组,转染加白藜芦醇处理组,通过实时定量聚合酶链反应分别检测各组细胞中Frizzled-2及Wnt5a的基因表达水平：通过免疫印迹法分别检测各组细胞中Frizzled-2及Wnt5a的蛋白表达水平；Fluo-3孵育细胞后,用激光共聚焦显微镜检测各组细胞胞浆内钙离子荧光强度。计量资料用均数±标准差显示。采用SPSS13.0(Chicago,IL, USA)进行统计学分析,采用单因素方差分析分析,方差齐性检验方差齐时,采用F检验,方差齐性检验方差不齐时,采用近似F检验(Welch法),采用LSD方法进行组间两两比较统计(方差齐),方差不齐时采用Games-Howell法进行两两之间的比较统计(方差不齐),p<0.05作为有统计学差异。结果1.通过培养H9C2心肌细胞并建立体外缺氧复氧模型,对体外培养的细胞经Fluo/3AM钙离子特异性荧光染料孵育后,行激光共聚焦显微镜检测钙离子荧光强度,与正常对照组比较,体外细胞缺氧3h/复氧4h后(H/R组),细胞中的钙离子荧光强度较正常对照组细胞显著增强(P<0.001),对缺氧/复氧细胞予三种不同浓度(5,25,100umol/l)白藜芦醇后处理,三组细胞钙离子荧光强度分别较缺氧/复氧组细胞钙离子荧光强度显著降低(P<0.001),白藜芦醇后处理的三组之间,随着RES浓度的升高,细胞内钙离子荧光强度有降低的趋势,(见图1-2,表1-1)。我们利用CCK-8法检测细胞活性的变化,与正常对照组比较,体外细胞缺氧/复氧后,细胞的存活率显著下降(P<0.001),对缺氧/复氧细胞予三种不同浓度(5,25,100umol/l) RES后处理,三组细胞的存活率较缺氧/复氧组均显著升高(P<0.01), RES后处理的三组之间比较,随着白藜芦醇浓度的增加,有提高细胞活性的趋势,(见图1-3,表1-2)。通过检测培养液中的LDH水平,来观察白藜芦醇对H/R心肌细胞损伤的影响(如图1-4,表1-3所示),与正常对照组比较,缺氧/复氧组细胞培养液中的LDH水平显著升高(P<0.001),将缺氧/复氧细胞予三种不同浓度(5,25,100umol/l) RES后处理,药物后处理各组培养液中的LDH水平较缺氧/复氧组均显著降低(P<0.01)。利用Alexa Fluor488Annexin YFITe/Pl双染色法,用流式细胞仪检测H9C2心肌细胞凋亡率(如图1-5,表1-4所示),与正常对照组比较,缺氧/复氧组细胞凋亡率显著升高(P<0.001),对缺氧/复氧细胞予三种不同浓度(5,25,100umol/l)白藜芦醇后处理,与缺氧/复氧组相比较,白藜芦醇后处理三组的细胞凋亡率均显著降低(P<0.01)。我们利用Caspase-3试剂盒检测各组细胞的Caspase-3活性,与正常对照组比较,缺氧/复氧细胞Caspase-3活性显著升高(P<0.01),对缺氧/复氧细胞予三种不同浓度(5,25,100umol/l)白藜芦醇后处理,各组细胞Caspase-3活性较缺氧/复氧组均显著降低(P<0.001),(见图1-6,表1-5)。2.通过实时定量聚合酶链反应对各组中Frizzled-2及Wnt5a基因表达进行定量检测,结果发现：正常对照组比较,缺氧/复氧组心肌细胞Frizzled-2及Wnt5a基因表达水平分别升高5.876±0.180和3.468±0.180倍,Frizzled-2及Wnt5a表达较正常对照组均显著增强(P<0.01)；对缺氧/复氧细胞予三种不同浓度(5,25,100umol/l)白藜芦醇后处理,后处理各组心肌细胞Frizzled-2基因表达水平分别较对照组升高4.238±0.118,2.550±0.187及2.263±0.117倍,与缺氧/复氧组比较,后处理各组Frizzled-2基因表达均显著降低(P<0.01)；后处理各组心肌细胞Wnt5a基因表达水平较正常对照组分别升高2.398±0.092,1.993±0.153及1.627±0.116倍,与缺氧/复氧组比较,后处理各组Wnt5a基因表达均显著降低(P<0.01)；且白藜芦醇后处理的三组中,随着RES浓度增高,降低Frizzled-2及Wnt5a基因表达的趋势越明显,(见图2-1,表2-1)。通过免疫印迹法对各组中Frizzled-2及Wnt5a蛋白表达进行检测,结果发现：正常对照组Frizzled-2及Wnt5a基因表达水平分别为0.203±0.017,0.407±0.025,缺氧/复氧组心肌细胞Frizzled-2及Wnt5a基因表达水平分别为1.142±0.072和0.915±0.071,缺氧/复氧组心肌细胞Frizzled-2及Wnt5a蛋白表达较对照组均显著增强(P<0.001)；对缺氧/复氧细胞予三种不同浓度(5,25,100umol/l)白藜芦醇后处理,后处理各组心肌细胞Frizzled-2蛋白表达水平分别为0.829±0.023,0.505±0.037及0.402±0.026,与H/R组比较,各组Frizzled-2蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)；后处理各组心肌细胞Wnt5a蛋白表达水平分别为0.707±0.050,,0.601±0.037及0.556±0.039,与缺氧/复氧组比较,各组Wnt5a蛋白表达水平均显著降低(P<0.01)；药物后处理的三组中,随着药物浓度增高,有降低Frizzled-2及Wnt5a蛋白表达的趋势,(见图2-2,表2-2)。3.我们首先合成Frizzled-2基因,以pEGFP-C1为载体,构建pEGFP-C1-Frizzled-2质粒,通过质粒基因测序,证实了质粒的基因序列与目的基因Frizzled-2一致(如图3-1所示),再将pEGFP-C1-Frizzled-2质粒结合Lipo2000转染至H9C2细胞。利用实时定量聚合酶链反应对各组中Frizzled-2及Wnt5a基因表达进行定量检测(如图3-2,表3-1所示),结果发现：与正常对照组比较,经Frizzled-2全基因转染后,心肌细胞Frizzled-2及Wnt5a基因表达水平分别升高6.798±0.311和3.003±0.217倍,Frizzled-2及Wnt5a基因表达水平较对照组均显著增强(P<0.01)；对Frizzled-2基因转染细胞同时予10umol/l白藜芦醇处理,白藜芦醇处理组心肌细胞Frizzled-2及Wnt5a基因表达水平分别为对照组的4.040±0.249和1.844±0.197倍,与单纯Frizzled-2基因转染组比较,白藜芦醇处理组细胞Frizzled-2及Wnt5a基因表达显著降低(P<0.01)。通过免疫印迹法对各组中Frizzled-2及Wnt5a蛋白表达进行检测,结果发现：正常对照组Frizzled-2及Wnt5a蛋白表达水平分别为0.197±0.010,0.407±0.025,经Frizzled-2全基因转染后,心肌细胞Frizzled-2及Wnt5a蛋白表达水平分别为1.295±0.028和0.801±0.019,Frizzled-2及Wnt5a蛋白表达较对照组均显著增强(P<0.01)；转染的同时对转染细胞予10umol/l白藜芦醇处理,白藜芦醇处理组心肌细胞Frizzled-2及Wnt5a蛋白表达水平分别为0.801±0.017,0.602±0.013,与单纯转染组比较,处理组心肌细胞Frizzled-2及Wnt5a蛋白表达均显著降低(P<0.01),(见图3-3,表3-2)。利用Fluo/3AM钙离子特异性荧光染料孵育细胞,用激光共聚焦显微镜检测各组细胞胞浆内钙离子荧光强度(如图3-4,表3-3所示),结果发现：Frizzled-2基因转染后,细胞内的钙离子荧光强度(0.0288±0.0021)较正常对照组细胞内钙离子荧光强度(0.0100±0.0008)显著增强(P<0.01),白藜芦醇处理组细胞内钙离子荧光强度为0.0182±0.0012,与单纯转染组比较,钙离子荧光强度显著降低,(P<0.01)。结论1.本研究通过缺氧/复氧诱导H9C2心肌细胞损伤模拟心肌缺血再灌注损伤,采用不同浓度白藜芦醇后处理干预缺氧/复氧心肌细胞,结果表明结果表明白藜芦醇不但在较低浓度下通过抑制缺氧/复氧心肌细胞内钙超载,具有抗损伤、抗凋亡的后适应效应,且在较大的浓度范围内(<100umol/l), RES后处理仍然具有显著抑制H/R心肌细胞内钙超载及抗损伤、抗凋亡的后适应作用。2.通过缺氧/复氧诱导H9C2心肌细胞损伤模拟心肌缺血再灌注损伤,采用不同浓度白藜芦醇后处理干预缺氧/复氧心肌细胞,结果表明Wnt5a及Frizzled-2在正常H9C2心肌细胞少量表达,并在缺氧/复氧损伤后表达显著上调；在一定的剂量范围内(5-100 umol/l), RES后处理能从基因及蛋白水平显著减少缺氧/复氧心肌细胞Wnt5a及Frizzled-2的表达。3.将包含Frizzled-2全基因的质粒转染至H9C2细胞,并对Frizzled-2基因转染细胞同时进行白藜芦醇处理,结果表明：经白藜芦醇的干预,可抑制Frizzled-2基因转染心肌细胞内上调的Frizzled-2和Wnt5a基因及蛋白的表达水平；并降低Frizzled-2基因转染心肌细胞胞浆内的钙离子浓度,这可能是RES减轻缺氧/复氧心肌细胞钙离子超载的分子机制之一。