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目的:检测新型壳聚糖（CS）/丝素蛋白（SF）/纳米羟基磷灰石（n-HA）多层复合支架的结构、生物力学特性以及细胞相容性和动物体内的可降解性;观察三维培养体系中周期性压力对骨髓间充质干细胞/支架复合体的成软骨分化诱导效应;观察骨髓干细胞/支架复合体修复小型猪单侧股骨髁软骨缺损的效果方法:常温沉淀法,以四水合硝酸钙和磷酸氢二钙为原料得到纯n-HA;提取SF;配制CS:SF浓度比为1:3、2:2、3:1的CS/SF混合液,制备支架上面三层;CS、n-HA以3:7的比例用原位沉淀法合成CS/n-HA复合物,制备支架底层。采用低温冷冻成型法,逐层塑模、冻干,2%NaHCO3浸泡中和,三聚磷酸钠（TPP）交联,提升支架力学强度。液体置换法测定支架孔隙率;HE染色观察支架内部结构,在支架的每个层次随机选取20个孔隙,利用Image Pro Plus 5.0图像处理软件,测量和计算各层次平均孔径。力学测试机测定支架干、湿状态下的压缩模量。Micro-CT和扫描电镜观察支架细微结构。取材SD大鼠骨髓间充质干细胞,对其进行成骨、成脂、成软骨三系分化鉴定和传代扩增。CCK-8检测支架毒性。HE染色、钙黄绿素染色、扫描电镜观察细胞/支架共培养。SD大鼠背部皮下包埋观察支架在动物体内的降解性。取材小型猪骨髓间充质干细胞,对其传代、纯化、扩增。通过CCK-8和活/死细胞染色检测不同培养条件下细胞/支架复合体上细胞的代谢情况与活力。力学测试机检测动态培养体系中细胞/支架复合体的压缩模量。通过甲苯胺蓝染色、Western Blotting、RT-qPCR、Elisa等方法观察、检测不同培养条件下细胞/支架复合体上细胞的成软骨分化情况。通过Western Blotting和RT-qPCR检测不同培养条件下相关信号通路（Erk1/2、p38、Smad1/5、Smad2/3、BMP2）的磷酸化激活情况。小型猪单侧下肢股骨髁软骨缺损造模。磁共振、肉眼观、HE染色及番红O-固绿染色观察不同培养条件下的细胞/支架复合体对软骨缺损的修复作用。结果:制备的4cm直径、4mm厚度的壳聚糖/丝素蛋白/纳米羟基磷灰石白色圆饼形支架,内部分为四层,各层紧密相连,遍布互通的孔隙,孔隙率高达92.2±1.3%,各层平均孔径均显著大于骨髓干细胞。培养基饱和状态的湿润支架的压缩模量显著高于干燥支架。支架无毒性,细胞/支架共培养显示细胞在支架上粘附和迁移并维持良好的代谢水平。支架在动物体内可以降解、吸收,降解速度适宜。对动态培养系统（生物反应器）的参数设定可以模拟人在正常行走时,自身重力对关节软骨的挤压作用。周期性压力可以促进支架上骨髓间充质干细胞的代谢,增强其活力、减少其凋亡;可以显著提升细胞/支架复合体的压缩模量;可以促进支架上骨髓间充质干细胞的成软骨分化。MAPK（p38及Erk）通路、BMP2、Smads相关通路因子均参与到周期性压力作用下的干细胞成软骨分化过程中;这个过程中,p38、BMP2、Smad1/5、Smad2/3磷酸化激活;Erk磷酸化抑制结论:CS/SF/n-HA多层复合仿生支架具备良好的力学特性、细胞相容性和动物体内可降解性。周期性压力作用于骨髓间充质干细胞/支架复合体,可以促进支架上细胞的代谢水平;保持细胞活力,抑制其凋亡;增强细胞/支架复合体的压缩模量;促进支架上细胞的成软骨分化;促进p38、BMP2、Smad1/5、Smad2/3磷酸化激活,抑制Erk1/2的磷酸化。周期性压力作用下的骨髓干细胞/支架复合体表现出良好的软骨修复作用