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结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一。肝脏是CRC最常见的转移部位,结直肠癌肝转移(colorectal cancer liver metastases)也是这些患者死亡的主要原因。结直肠癌古称“肠蕈”、“锁肛痔”、“肠积”、“肠溜”等。中医把CRC发生转移谓之“传舍”,目前关于CRLM的病机研究报道较多,主要与癌毒耗散正气,正虚与标实相互作用密切相关。正虚包括脾虚,气虚,血虚,阴虚,阳虚,标实包括气滞血瘀、痰湿凝聚、热毒。正虚与标实互结是CRC的病理基础,痰毒流注是CRLM的基本途径。已经有学者报道CRC中医证型与发生肝转移具有一定的关系,但CRC发生肝转移的关键病机是什么,目前这方面的研究尚未见报道。Hippo信号通路与多种肿瘤相关,有学者发现,结肠癌复发、转移和耐药与Hippo信号通路核心癌基因Yes相关蛋白(yes-associatedprotein,YAP)息息相关,近年研究发现G蛋白耦联受体信号通路(以下简称GPCRs)可调控Hippo信号通路。调节机制是:溶血磷脂酸(以下简称LPA)、1-磷酸鞘氨醇(以下简称S1P)。LPA和S1P通过激活G12/13或Gq/11耦联受体而抑制LATS1/2激酶活性,使YAP活化。相反,肾上腺素(AD或EPI)和胰高血糖素(GC)则可抑制YAP活化。寻找通过GPCRs干预Hippo通路的潜在药物具有十分重要的价值。Hippo信号通路在结直肠癌肝转移的发生和发展中,起着重要作用,但其机制并未完全阐明。其与CRLM中医证的相关性研究目前国内未见报道。因此本实验旨在通过对128例CRLM患者(以128例CRC患者作为对照)进行前瞻性研究,发现CRC发生肝转移的关键病机是什么,并以此构建CRLM病证结合动物模型,研究中药对CRLM病证结合动物模型Hippo信号通路的影响,探索中药作用干预靶点,可望为深入挖掘证的现代科学内涵和中医中药攻克本病高转移率这一瓶颈问题开辟新路子。第1章结直肠癌肝转移患者中医证及相关因素研究目的分析结直肠癌和结直肠癌肝转移患者的中医证及临床相关因素,探寻结直肠癌发生肝转移中医病机相关因素及客观指标。方法采用前瞻性流行病学调查方法,分析研究患者临床流行病学资料和肿瘤标志物水平。结果结直肠癌患者虚证:脾虚72例,气虚55例,血虚21例,阳虚5例,阴虚7例,实证:痰湿47例,气滞3例,血瘀14例,热毒8例,结直肠癌肝转移患者虚证:脾虚89例,气虚62例,血虚24例,阳虚3例,阴虚6例,实证:痰湿37例,气滞6例,血瘀20例,热毒6例,结直肠癌发生肝移与转是否脾虚相关具有统计学意义(P<0.05),与病理分型有关,其中溃疡性腺癌更易发生肝转移具有统计学意义(P<0.05),与肿瘤侵犯程度有关,侵犯浆膜下或无腹膜覆盖的结直肠旁组织更易发生肝转移具有统计学意义(P<0.01),与淋巴结转移数有关具有统计学意义(P<0.01),与血清 CEA,CA242,CA19-9,CA50,CA724,CA125,CA153,血浆 D-二聚体有关具有统计学意义(P<0.05),ROC曲线分析诊断效能:联合检测>血清CEA>血清CA242>血清CA199>血浆D-二聚体>血清CA125>血清CA724>血清CA50>血清CA125。结直肠癌与结直肠癌肝转移脾虚患者血清CEA,CA199,CA125,血浆D-二聚体诊断阳性率高于非脾虚患者(P<0.05)。结论中医辨证是否脾虚,以及年龄,肿瘤病理分型,侵犯程度,肠周淋巴结转移数,血清 CEA,CA153,CA242,CA199,CA50,CA724,CA125,血浆 D-二聚体与结直肠发生肝转移高度相关,几种肿瘤指标联合检测能增加诊断率,首次研究发现血清CEA,CA199,CA125,血浆D-二聚体可作为结直肠癌与结直肠癌肝转移脾虚证量化指标,对结直肠癌发生肝转移的监测、诊断及中西医治疗具有临床指导意义。第2章结直肠癌肝转移脾虚证病证结合小鼠模型的建立目的比较三种小鼠结直肠癌肝转移动物模型,并以此构建结直肠癌肝转移脾虚证病证结合小鼠模型。方法1)用脾保留模型探讨癌细胞浓度与肝转移率/小鼠存活率之间的关系。用筛选的细胞浓度,评估脾保留模型,脾全切模型和脾半切模型的优劣及与CEA、CA199、AFP的相关性。2)40只BALB/c小鼠随机分为假手术组为A组,脾虚组为B组,肠癌肝转移组为C组和肠癌肝转移脾虚组为D组。A组和B组将小鼠开腹后脾脏下极注入不含瘤细胞的细胞悬液,切除注射的半脾后关腹,C组和D组将小鼠结肠腺癌细胞(CT26)注入脾的下极后切除,关腹,术后第三天A组和C组予以生理盐水灌胃7 d,B组和D组予以生大黄水煎液灌胃7d,10d后旷场实验比较造模前后小鼠自发活动,肝HE染色确定造模成功。结果1)脾内接种小鼠结肠腺癌细胞(CT26)第10 d,肝转移率为100%。当注射0.15 mL的CT26细胞(0.5×107/mL～1.5×107/mL)时,小鼠存活率高(P<0.05)。脾保留模型,脾全切模型和脾半切模型均能成功建模,脾半切模型第7 d肝转移率最高(P<0.05),脾半切模型的预期寿命最长(P<0.05)。三种模型的血清CEA和CA199均高于对照组(P<0.05)。三种模型的血清AFP低于对照组(P<0.05)。2)旷场实验结果:四组造模前10 min总路程与平均速度差异无统计学意义(P>0.05),A组造模前后总路程与平均速度差异无统计学意义(P>0.05),造模后B,C,D组10 min总路程与平均速度低于A组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1)脾半切模型是一种更优良的的结直肠癌肝转移小鼠建模方法。2)脾半切模型结合生大黄灌胃可建立符合临床证型的结直肠癌肝转移的病证结合动物模型。第3章基于Hippo信号通路探讨中药干预结直肠癌肝转移脾虚证小鼠机制目的应用小鼠结直肠癌半脾切除肝转移模型研究Hippo信号通路的作用,同时初步探索加味四君子汤方药对结直肠癌肝转移脾虚小鼠模型的干预靶点。方法1)20只BALB/c小鼠随机分为假手术组和实验组。假手术组将小鼠开腹后关腹,实验组将小鼠结肠腺癌CT26细胞注入脾的下极后切除,建立肝转移模型。7d后小鼠处死并解剖。酶联免疫吸附法(ELISA法)检测小鼠眼球血中肾上腺素(epinephrine,EPI)、胰高血糖素(glucagon,GC)、溶血磷脂酸(lysobisphosphatidic acids,LPA)和 1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1 phosphate,S1P)的含量;HE 染色结果确定脾半切除肝移植瘤造模成功,免疫组织化学法对Yes相关蛋白 1(yes-associatedprotein 1,YAP1)和磷酸化 YAP1(phospho-yes-associatedprotein 1,p-YAP1)进行定位,蛋白质印迹(Westernblot)法检测肝组织中YAP 1和p-YAP 1的表达水平。2)建立结直肠癌肝转移脾虚证小鼠病证结合动物模型70只,随机分为模型对照A组,西药卡培他滨(化疗药)B组,盐酸芬戈莫德(S1P受体抑制剂)靶向药C组,抗癌平丸中成药D组,加味四君子汤低、中、高E、F、G组,治疗14 d,小鼠眼球取血,处死,解剖。ELISA法检测小鼠血清LPA、S1P、GC、AD、含量,蛋白质印迹(Western blot)法检测肝组织中YAP1和p-YAP1的表达水平。结果1)小鼠结直肠癌半脾切除模型建立7 d后肝转移率为100%;假手术组血浆中EPI与GC的含量均明显高于实验组(P值均<0.01),实验组小鼠血浆中LPA与S1P的含量均明显高于假手术组(P值均<0.01);实验组肝组织HE染色结果显示典型的低分化腺癌特征,有核分裂现象。假手术组正常肝组织中YAP1蛋白表达在细胞质中[细胞核YAP1(—),细胞质YAP1(+)],p-YAP1蛋白在细胞质和细胞核中均有表达[细胞核p-YAP1(+),细胞质p-YAP1(+)];实验组肝肿瘤组织中YAP1蛋白在细胞质和细胞核中均有表达[细胞核p-YAP1(+),细胞质p-YAP1(+)],p-YAP1蛋白在细胞核与细胞质中均未见表达[细胞核p-YAP1(-),细胞质p-YAP1(-)]。YAP1在实验组肝肿瘤组织中的表达水平明显高于假手术组(P<0.01),p-YAP1在实验组肝肿瘤组织中的表达水平明显低于假手术组(P<0.01)。2)与A组相比,B、C、D、G组小鼠血浆中EPI、GC水平高于A组,LPA和S1P水平低于B组,差异有明显的统计学意义(P<0.01),E、F组与A组相比无统计学意义(P>0.05)。与A组相比,B、C、G组YAP1蛋白表达明显下调,差异有明显的统计学意义(P<0.01),与A组相比,B组YAP1蛋白表达明显上调,差异有明显的统计学意义(P<0.01)。结论1)发现建立结直肠癌肝转移模型EPI、GC与YAP1表达呈负相关,与p-YAP1表达呈正相关,LPA、S1P与YAP1呈正相关,与p-YAP1呈负相关。2)加味四君子汤可能通过调控Hippo信号通路,下调YAP1,上调p-YAP1发挥抗肿瘤作用。