为解决现有骨替代材料活性低的缺点,达到修复较大面积骨缺损的目的而制备载生长因子的纳米微球并将其与接近骨细胞外基质的生物材料复合在一起,构建三维支架,使之具备更优良的诱导成骨特性和安全性。一、研究乳化交联法制备条件对壳聚糖微球质量的影响,结果表明最佳条件是:搅拌速率为1,000转/分钟,醋酸的质量百分比浓度为2%,壳聚糖浓度为10mg/mL,油水比(v/v)为4:1,交联剂为1 mL,交联温度为30℃,以及span-80的用量为1.2 g,制备得到的壳聚糖微球粒径分布均匀,粒径为150~350 nm。以空白壳聚糖微球吸附TGF-β1,使用ELISA试剂盒和酶标仪测定吸附量,绘制吸附曲线,结果表明:TGF-β1在6小时时达到吸附平衡,并表现为二级动力学吸附。壳聚糖微球对TGF-β1的载药率为(3.830±0.002)ng/mg,吸附率为0.8972±0.0037。二、研究离子凝胶法制备条件对壳聚糖微球质量的影响,结果表明:以1mg/mL壳聚糖溶液和1 mg/mL三聚磷酸钠溶液为制备液,在壳聚糖与三聚磷酸钠质量比为5:1~6:1、壳聚糖溶液pH值为5.0~6.0时,可得到较多粒径分布均匀,粒径为150~350 nm的壳聚糖微球。吸附曲线表明:BMP-2在100 min时达到吸附平衡,并表现为二级动力学吸附。壳聚糖微球对BMP-2的载药率为(7.225±0.002)ng/mg,吸附率为0.9207±0.0020。三、空白壳聚糖微球同时吸附TGF-β1和BMP-2的实验中,离子凝胶法所制备的壳聚糖微球6小时时对TGF-β1的吸附达到平衡状态,其载药率为(5.030±0.002)ng/mg,吸附率为0.9242±0.0020;而2小时时对BMP-2的吸附就达到平衡状态,其载药率为(2.890±0.002)ng/mg,吸附率为0.9233±0.0033。壳聚糖微球对TGF-β1和BMP-2均表现为二级动力学吸附。四、配制固定质量比例、不同固形物含量的混合生物材料水凝胶,通过冷冻干燥法构建海藻酸钠/透明质酸钠/胶原蛋白支架。FTIR表征支架材料化学结构。SEM观察可见支架的三维多孔结构,孔径为100?250μm。冷冻干燥法测得支架的含水率随固形物含量增加呈现下降的趋势。排液法测定支架孔隙率均在90%以上。电子拉力机测定支架的拉伸强度随固形物含量增加而上升,断裂伸长率降低。选择合适的生物材料支架,接种ADSCs细胞培养,CCK-8检测结果描绘其生长曲线。发现在支架上细胞的生长与空白对照组相比并没有显著差异,SEM观察发现细胞在支架上粘附良好,显示该生物材料支架细胞相容性好。五、构建负载TGF-β1和BMP-2壳聚糖微球复合海藻酸钠/透明质酸钠/胶原蛋白支架,接种ADSCs进行成骨诱导分化。该复合支架组的ALP活力定量、骨钙素表达以及VK矿化结节染色鉴定等三个成骨指标均高于空白对照组,证实了载生长因子多孔支架能有效地定向诱导成骨。而CCK-8检测结果、HE染色和显微观察结果显示该支架组细胞的生长与空白对照组相比并没有显著差异。因此,负载TGF-β1和BMP-2壳聚糖微球复合海藻酸钠/透明质酸钠/胶原蛋白支架具有较强的成骨诱导分化能力,在颌骨修复的组织工程领域具有潜在的应用价值。