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普鲁兰酶是一种脱支酶,能够专一性切割淀粉、普鲁兰多糖等聚合物中的α-1,6糖苷键。普鲁兰酶在淀粉加工工业中可提高底物利用率,降低产品成本。实验室前期研究中以淀粉为底物,使用Arthrobacter ramosus S34来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)制备海藻糖,由于该两种酶都不能水解底物中的a-1,6糖苷键,因此加入性质与这两种酶吻合(温度45℃,pH 5.5)的普鲁兰酶能够大幅度提高底物的利用率和海藻糖的转化率。嗜酸芽孢杆菌普鲁兰酶(BapulA)和长野芽孢杆菌普鲁兰酶(BnpulB)和上述两种酶性质相符,可用于海藻糖的制备。本研究将普鲁兰酶BapulA和BnpulB,分别在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达,并优化重组菌的发酵条件以及海藻糖酶转化过程中的影响因素。主要研究结果如下:(1)将嗜酸芽胞杆菌普鲁兰酶基因密码子优化后人工合成,得到重组质粒pET-20b(+)-BapulA。将该质粒转化大肠杆菌,构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)-BapulA;在摇瓶中进行发酵,最高酶活达到 201.0 U·mL-1。在 3L发酵罐水平进行发酵条件的优化,结果表明,重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-20b(+)-BapulA在生长阶段的最适温度和pH分别是30℃和7.0,最佳诱导时间点是菌体OD600为50,诱导阶段的最适温度和pH分别是25℃和6.2,乳糖的诱导流速为0.4 g·L-1·h-1;在OD600分别达到15,45和75时,加入1.5 g·L-1的甘氨酸,OD600达到105时加入3 g·L-1的甘氨酸,最高酶活达到 1910.1 U·mL-1。(2)构建重组质粒 pHY300PLK-BapulA,并转化宿主菌 B.subtilis CCTCCM 2016536,得到重组菌B.subtilis CCTCCM2016536/pHY300PLK-BapulA。将该菌株进行摇瓶发酵,发酵液上清的酶活为0.8 U.mL-1。对重组菌的培养条件进行优化,摇瓶最高酶活达到23.4 U·mL-1,相比优化前提高28倍。(3)将长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因密码子优化后人工合成,得到重组质粒pET-22b(+)-BnpulB。将该质粒转化大肠杆菌,构建重组菌E.coliBL21(DE3)/pET-22b(+)-BnpuB;在摇瓶中进行发酵,最高酶活达到568.5 U·mL-1。(4)构建重组质粒 pHY300PLK-BnpulB,并转化宿主菌 B.subtilis CCTCCM2016536,获得重组菌B.subtilis CCTCC M 2016536/pHY300PLK-BnpulB,并进行摇瓶发酵,发酵液上清的酶活为80.4U·mL-1。在摇瓶中优化了发酵培养基的碳源和氮源的种类,最佳碳源是葡萄糖,最佳复合氮源为酵母浸粉与磷酸二氢铵(NH4H2PO4)。进而在3 L发酵罐水平优化补料培养基,当400g·L-1葡萄糖为碳源,100g·L-1酵母浸粉为唯一氮源时,酶活最高为2361.1 U·mL-1,是摇瓶酶活的29倍。(5)以淀粉为初始底物,分别添加两种普鲁兰酶(BapulA和BnpulB)与麦芽糖基海藻糖合成酶和水解酶复配反应生成海藻糖,考察了酶转化过程中温度、初始pH、底物浓度以及普鲁兰酶加酶量等条件对转化率的影响,最佳反应温度是45℃,最佳初始pH为6.0,最适底物浓度为15%,BapulA最优加酶量是15U g-1淀粉,底物转化率为66.7%;BnpulB最优加酶量是2 U·g-1淀粉,底物转化率为67.9%。