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第一部分TIEG1基因在TGF-β1介导肝癌细胞生长抑制中的作用研究背景:肝癌是世界上第五大恶性肿瘤,晚期患者治疗难度大、疗效差,目前尚无有效的治疗策略。因此研究肝癌的发病机制,寻找新的治疗靶点和疗法是目前研究热点。TGF-β在体外能抑制肝细胞增殖和诱导细胞凋亡,在体内控制肝细胞的生长,维持肝脏大小。然而,在肝癌细胞中,往往对TGF-β失去敏感性,被认为是肝癌发病的机制之一,但其机理尚未完全阐明。研究目的:通过筛选对TGF-β1不同敏感程度的细胞株(包括正常肝细胞和肝癌细胞),以此为模型,研究肝癌细胞对TGF-β敏感性缺失的主要原因以及TIEG1抑制肝癌细胞生长的作用机制。研究方法:选取了对TGF-β敏感的肝癌细胞株Hep3B和正常永生化的肝细胞株MIHA,以及对TGF-β不敏感的两株肝癌细胞株(HepG2、Bel7404)做为细胞模型。TGF-β1处理0、0.5、1、2、4 h后,RT-PCR方法检测TGF-β不同敏感程度的细胞株之间TGF-β信号通路主要相关基因表达的差异;利用siRNA抑制TGF-β敏感肝癌细胞Hep3B的TIEG1表达,观察细胞对TGF-β1敏感性的改变;利用慢病毒载体在TGF-β不敏感肝癌细胞(HepG2、Bel7404)中过表达TIEG1,研究TIEG1在TGF-β1对肝癌细胞生长抑制中的作用。Western blot检测TGF-β1和TIEG1对stathmin表达的影响;萤光素酶报告基因检测TIEG1对stathmin启动子的调控;采用染色质免疫共沉淀方法,观察TIEG1对stathmin启动子区域的直接结合作用;并进一步在TIEG1过表达的肝癌细胞中同时过表达stathmin,研究对逆转TIEG1抑制细胞生长的作用。研究结果:(1)在检测TGF-β1处理细胞后的早期基因反应中,发现在TGF-β敏感的细胞(Hep3B、MIHA)中,TGF-β1能强烈诱导TIEG1基因表达上调(7～11倍),并在1h时达到高峰;而在对TGF-β不敏感的细胞(HepG2、Bel7404)中,TIEG1基因表达只有微弱的上调(2～3倍),TGF-β敏感的细胞中TIEG1基因表达变化显著高于TGF-β不敏感的细胞。(2)应用siRNA抑制TGF-β敏感肝癌细胞Hep3B中TIEG1基因表达,可以使Hep3B细胞对TGF-β1的敏感性降低。(3)在TGF-β不敏感的肝癌细胞(HepG2、Bel7404)中过表达TIEG1,可以抑制肝癌细胞的增殖和诱导凋亡。(4) TIEG1可以通过直接结合stathmin启动子区域,调控启动子活性,下调stathmin的表达;TGF-β1处理敏感肝癌细胞Hep3B也可使stathmin表达下调。(5)在TIEG1过表达的肝癌细胞中同时过表达stathmin,可以明显逆转TIEG1对肝癌细胞的生长抑制作用。结论:(1) TGF-β1处理后,TIEG1基因早期表达反应能力的减弱,是导致肝癌细胞对TGF-β1丧失敏感性的主要原因。(2)阐明了TGF-β1对TIEG1基因及下游stathmin的调控作用,提出假设的“TGF-β1—＞TIEG1—＞stathmin—＞细胞增殖抑制”新的信号通路,揭示TIEG1基因在TGF-β1介导肝癌细胞生长抑制中的重要作用。本研究为探讨肝癌发病机制,寻找新的治疗靶点提供了实验依据。第二部分慢病毒载体过表达TIEG1对胰腺癌细胞生长抑制和化疗药物的增敏作用研究背景:胰腺癌是目前已知的恶性程度最高的肿瘤之一。近年来,人胰腺癌的发病率和死亡率呈上升趋势,严重影响着人们的生活质量。大部分胰腺癌细胞对化疗药物耐药,导致胰腺癌预后极差。寻找更加有效的治疗方法,成为目前胰腺癌治疗的关键。TIEG1可以诱导TGF-β敏感胰腺癌细胞凋亡,抑制细胞生长,但对TGF-β不敏感胰腺癌细胞生长和化疗药物敏感性的影响尚未阐明。研究目的:研究在胰腺癌细胞中过表达TIEG1对胰腺癌细胞生长和化疗药物敏感性的影响,并探讨其作用机制。研究方法:利用慢病毒转基因系统,在胰腺癌细胞株(SW1990和Canpan-2)以及永生化正常胰腺导管细胞株(HPDE6-E6E7-c7)中过表达TIEG1,MTT法测定其对胰腺癌细胞和正常细胞生长抑制作用的差异;DAPI染色法检测TIEG1对胰腺癌细胞凋亡的影响;MTT法测定过表达TIEG1后,胰腺癌细胞对化疗药物吉西他滨敏感性的改变;实时定量PCR和Western blot方法检测TIEG1对胰腺癌细胞stathmin表达的影响;用慢病毒过表达stathmin,研究对逆转TIEG1抑制胰腺癌细胞生长的作用;利用特异性siRNA抑制stathmin的表达,观察对胰腺癌细胞生长的影响。研究结果:(1)慢病毒载体过表达TIEG1基因能抑制胰腺细胞生长,并且在肿瘤细胞中抑制效果明显高于正常胰腺癌细胞株,具有统计学意义。(2)过表达TIEG1基因可以诱导胰腺癌细胞凋亡,促进肿瘤细胞对化疗药物吉西他滨的敏感性。(3) TIEG1可以下调胰腺癌细胞stathmin的表达;同时用慢病毒转染方法过表达stathmin可以一定程度逆转TIEG1基因对肿瘤细胞的生长抑制作用。(4)用siRNA转染胰腺癌细胞,下调stathmin的表达,也可以抑制胰腺癌细胞的生长。结论:TIEG1基因主要通过下调stathmin表达抑制胰腺癌细胞株的生长,促进对化疗药物吉西他滨的敏感性,有可能成为胰腺癌基因治疗及联合化疗药物治疗的新靶点。