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H1N1亚型猪流感病毒是猪流感(Swine influenza,SI)的重要病原之一,为正粘病毒科、A型流感病毒属,由8个分节段的基因组构成,共编码11种蛋白。H1N1亚型猪流感1918年美国最先报道,2009年一种新型甲型流感病毒引发的疫情迅速在世界范围内蔓延,引发全球人类流感大流行。2009甲型H1N1流感已突破种间屏障能感染猪、犬、雪貂等动物,相继在北美、南美和亚洲出现2009甲型H1N1猪流感疫情,发生人与猪、猪与猪之间的互相传播。因此,开展对H1N1亚型SIV的遗传演化分析和致病性研究具有重要意义。本研究对从2009年到2011年采自广西南宁、柳州、贺州、玉林、钦州、贵港和桂林等8个市发病猪群的肺组织病料2300份样品进行病毒分离。样品经常规处理后,接种9-10日龄的SPF鸡胚进行SIV的分离,共分离到9株H1亚型SIV,经HA和NA部分序列测定分析,有3株是2009甲型H1N1 流感病毒,分别命名为 A/Guangxi/1/2011(SwGX1/11)、A/Guangxi/3/2011(SwGX3/11)和 A/Guangxi/12/2011(SwGX 12/11)。对这 3 株分离毒株进行全基因序列测定,通过NCBI上的blast比较发现,3株H1N1亚型SIV与A/California/04/2009等2009年感染人的甲型H1N1流感病毒的进化关系接近,核苷酸序列同源性都在99.1%以上;3株分离株的推导氨基酸与A/California/04/2009 株相比,SwGX1/11 株有 26 个氨基酸变化,SwGX3/11株和SwGX12/11株各有16个氨基酸改变,氨基酸变化主要集中在HA和NA基因上,涉及到关键位点的有HA蛋白上225和226位点,NA蛋白上的119、295和386位点,NP蛋白上的375位点,特别是SwGX12/11株HA蛋白上226位点是Q,而225位点为G,是人甲流重症患者具有的分子特征。3株分离株在MDCK细胞上的生长良好,SwGX1/11株、SwGX3/11株和SwGX12/11株流感病毒每毫升种毒所含的TCID50分别为107.7、107.5和108.0。3株分离株以106TCID50病毒悬液50μL滴鼻攻毒BALB/c小鼠,SwGX1/11株和SwGX3/11株接毒小鼠平均体重下降最大值分别为9.13%和11.31%,SwGX12/11株在接毒的8只小鼠中有2只小鼠死亡,平均体重下降最大时为23.04%;小鼠接毒后第3天,SwGX1/11株、SwGX3/11株和SwGX12/11株在小鼠肺组织病毒TCID50/mL平均滴度分别是105.53±0.4、105.67±.29和106.2±0.35,鼻甲骨组织中病毒TCID50/mL平均滴度分别是103.83±0.42、102.73±0.44和105.73±0.64。结果表明3株甲型H1N1流感病毒都对小鼠有致病性,SwGX12/11株对小鼠致病性最强,是强毒型甲型H1N1流感病毒。为了进一步确定HA基因变化对小鼠致病力的影响,本研究选取SwGX12/11株流感病毒进行了拯救,用8质粒系统拯救出RSwGX12/11株病毒,该毒株全基因测序结果与野生型SwGX12/11株核苷酸序列同源性100%,对MDCK细胞的TCID50、鸡胚的EID50以及小鼠的致病性基本一致。在此基础上利用反向遗传技术对RSwGX12/11株的HA蛋白上225位点和226位点的氨基酸进行突变,获得了 HAmutQ226R株和HAmutG225D&Q226R株2株突变株。2株突变毒株对MDCK细胞的TCID50、鸡胚的EID50以及小鼠的致病性没有差异,但与获救亲本毒株RSwGX12/11株相比,除鸡胚的EID50没有变化外,在MDCK细胞的TCID50和小鼠的致病性差异显著,HAmutQ226R突变株和HAmutG225D＆Q226R株在MDCK细胞适应能力差,其TCID50/ml分别为104.5和103.8,而RSwGX12/11株在MDCK 细胞上的 TCID50/ml 是 107.5;HAmutQ226R 突变株和 HAmutG225D&Q226R株对小鼠的毒力也大幅度降低,两者感染小鼠的体重下降最低值分别为2.46%和2.35%,而亲本株RSwGX12/11株是24.33%,这表明HA蛋白226位上氨基酸残基的改变与H1N1流感病毒对小鼠的致病力有密切关系,当HA蛋白上226位点为精氨酸R时,HA蛋白上225位点为甘氨酸G或者为天冬氨酸D,H1N1甲型流感病毒对MDCK细胞的TCID50、鸡胚的EID50以及小鼠的致病性没有差异。本研究对广西猪群2009甲型H1N1流感病毒的流行病学、遗传进化和致病性等方面进行了系统研究,结果表明2009甲型H1N1流感病毒正在广西猪群中流行,毒株已发生了变异,毒力有增强的趋势,HA蛋白上225和226位点的氨基酸突变会大幅度改变病毒在MDCK细胞上的生长和对小鼠的致病性。研究结果为进一步开展SIV致病机制和防控技术研究提供重要的科学依据。