黑曲霉(Aspergillus niger)是一类常见的曲霉属真菌,作为一种典型的植物病原微生物,它普遍存在于各种粮食产品、园艺果蔬以及土壤里,可直接导致食物、谷物和果蔬的霉腐变质,每年对世界各国造成难以估量的经济损失。关于黑曲霉的致病机理及防治策略也一直是科研工作者们持续探寻的问题。而近些年,关于花青苷在抑制病原微生物方面的作用逐渐引起人们的关注,花青苷是植物中常见的次生代谢物,具有很强的抗氧化能力,与植物的抗逆及各项生理活动息息相关,并且对人类的健康也有着诸多益处;已经有相关研究报道证明了花青素可以有效抵抗一些病原微生物的侵害,然而,花青苷能否抑制黑曲霉及其机制,尚不清楚。因此本文探究了红皮梨中花青素对黑曲霉侵染的抑制作用,并进一步揭示了 WRKY家族转录因子调控红皮梨果皮中花青苷合成的分子机制。具体内容如下:鉴于黑曲霉是导致水果腐烂的一类主要病原微生物,本文使用了本试验室保存的野生型黑曲霉菌株及其基因缺失突变体(包括ΔcatA、ΔcpefB、ΔsodC,而catA cpeB和sodC基因已被证实与黑曲霉的抗氧化代谢相关,直接影响黑曲霉的致病力)在梨果实中进行了接种试验,发现在花青苷含量丰富的红茄梨中测定的病变直径大小普遍小于砀山酥梨上的病变直径,根据生物学方法测算,大小差异达到10%;表明花青苷含量更加丰富的红皮梨果实对于黑曲霉的侵染抵抗能力更强,证明了花青苷在植物机体拮抗微生物侵染方面发挥积极作用。并且这一差异性在黑曲霉ΔcpeB缺失体,ΔsodC缺失体和ΔcpeB-ΔsodC双缺失体侵染部位表现尤为明显,与野生型黑曲霉想比差异最高可达至15%,显著低于ΔcatA和ΔsodC缺失体引起的病变直径大小。这一结果体现了黑曲霉缺失体对花青素更加具有敏感性,表明黑曲霉中cpeB基因和sodC基因在响应花青苷胁迫作用中发挥重要作用。然后以花青苷含量高的红茄梨为材料,体外分离纯化得到花青素,进一步通过平板抑菌试验证了花青素能够抑制大肠杆菌和黑曲霉的正常生长。最后,通过RT-qPCR分析加以证明,和健康果皮相比,侵染区域果皮中与花青苷合成相关的基因,如PyMYB10、PyMYB114、PybHLH3、PyDFR、PyANS、PyUFGT、PyWRKY26、PyWRKY31 和 PyGST 等,其基因表达水平明显上调,这一结果表明病原微生物的侵染会导致植物自身花青素积累的变化这一自身应答反应。此外,本文通过对‘红茄梨’及其绿色芽变不同发育时期的果皮的转录组数据分析和生物信息学初步筛选,确定了转录因子PyWRKY31和PyWRKY26是参与调节花青苷生物合成的关键候选基因。通过RT-qPCR试验和相关性数据分析,发现在红皮梨“Starkrim son”中,PyDFR,PyANS,PyUFGT,PyMYB10,PyMYB114,PybHLH3,PyWRKY26,PyWRKY31,PyGST的基因表达水平均显著高于绿皮梨“金政一号”。相关性分析发现,这些涉及到花青苷的生物代谢途径的基因以及转录因子的基因表达水平与花青苷的含量之间存在着明显的正相关。为了进一步验证这些转录因子和花青苷合成之间的调控关系,本文通过烟草叶片以及草莓中瞬时表达试验,发现PyMYB10,PyMYB114和PybHLH3转录因子在单独转化时,在烟草和草莓果实中没有观测到色素积累现象;当PyMYB10+PybHLH3或PyMYB114+PybHLH3共转化时,可以观察到少量色素沉着;PyMYB114,PyMYB10和PybHLH3三种转录因子被共同注射时,有更为明显的颜色变化;而选转录因子PyWRKY26/PyWRKY31在分别与PyMYB10,PyMYB114和PybHLH3形成的转录复合物共同转化在烟草和草莓中时,大大增强了烟草和草莓果实中花色苷的积累。这些证据表明,PyWRKY26/PyWRKY31参与梨中花青苷的生物合成。为了进一步揭示PyWRKY31/PyWRKY26是如何参与调控花青苷的合成,本文进一步通过RT-qPCR分析和双荧光素酶报告系统证实,四个转录因子,PyMYB10、PyMYB114、PybHLH3和PyWRKY26/PyWRKY31共转化可以激活花青素生物合成过程中的关键基因PyDFR、PyANS和PyUFGT的表达,花青素转运中的PyGST基因的表达,但是对转运过程中涉及到的PyABC转运蛋白和PyAVP则没有明显激活效应。此外,PyWRKY26和PybHLH3的共同作用可以与PyMYB114启动子结合,并且PyWRKY26通过直接结合PyMYB114启动子激活其转录表达从而参与花青苷的生物合成调控。另外,通过荧光素酶互补和酵母双杂交试验,表明PyWRKY26可以与PybHLH3相互作用。该研究验证了花青素在梨果实中抵抗黑曲霉侵染方面有积极作用,红皮梨果实通过PyWRKY26和PybHLH3的相互作用共同靶向激活PyMYB114启动子,从而导致花青素在红皮梨中积累。本论文为花青苷拮抗微生物侵染的生理过程和梨果实中花色苷积累的调控网络提供了新的见解,并有望在今后植物性产品防治黑曲霉方面的工作提供一定的理论支持。