[研究背景]在我国,肥胖及Ⅱ型糖尿病已成为严重影响人们生命健康及生活质量的重大疾病,由此引发的以胰岛素抵抗为核心的高血糖、高血压、高血脂等并发症也已经给人类带来了沉重的负担。脂肪细胞分化是正常体内脂肪贮存的生理基础,脂肪细胞的增殖和分化异常会引起脂肪组织过多堆积,导致能量代谢失衡,引起肥胖以及与肥胖有关的一系列疾病。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)属核受体超家族成员,PPARs家族有PPARα、PPARβ、PPARy三个成员。它们在脂肪细胞中高表达,对脂肪分化、能量平衡和脂类生物合成意义重大。其中,PPARγ作为脂肪细胞分化的主要调节者,分为两个亚型:PPARγ1和PPARγ2。PPARγ2在鼠中比PPARy1多28个氨基酸,在人类中多30个氨基酸。PPARγ的表达和活性受到翻译后修饰的调节,包括磷酸化、类泛素化、泛素化、乙酰化和糖基化修饰等。CUL4B属于Cullin基因家族,在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。CUL4B的作用机制包括:参与细胞周期调控、维持基因组稳定性、调控相关通路、参与免疫调节、调控表观遗传学修饰等。此外,CUL4B是泛素连接酶E3的骨架蛋白,其氨基端与DDB1结合,羧基端与ROC1结合共同构成CUL4B-RING泛素连接酶(CRL4B)的核心结构。而DDB1则通过结合不同的底物受体DCAFs(DDB1 and CUL4-associated factors),特异性招募底物,并对底物进行泛素化修饰。近年来,本实验室研究发现,PPARγ可被CRL4B泛素化修饰,从而影响脂肪细胞分化和机体对胰岛素的敏感性。但其泛素化修饰机制尚不清楚,比如:PPARγ发生泛素化的赖氨酸位点以及PPARγ的泛素化与乙酰化之间的关系[研究目的]确认泛素化位点将有助于深入理解PPARγ的泛素化降解机制,为治疗肥胖相关的疾病提供理论基础。本课题发现PPARγ被CRL4B泛素化修饰的赖氨酸位点,明确PPARγ泛素化与乙酰化之间的关系,研究AhR的入核机制对PPARy泛素化水平的影响。[研究方法]利用邻位连接技术检测小鼠脂肪组织中PPARγ与AhR间的相互作用;利用定点突变和细胞内泛素化实验证明AhR所参与的PPARγ的泛素化修饰机制;利用蛋白质质谱分析、细胞内泛素化实验以及半衰期实验确定PPARγ的泛素化修饰位点。[研究结果]1、AhR负向调节脂肪分化。为了研究AhR对脂肪分化的影响,发现小鼠在cul4b缺失时,小鼠脂肪组织内PPARγ蛋白水平升高;利用邻位连接技术发现cul4b缺失时,PPARγ与AhR间的相互作用也明显增强;并且在脂肪分化过程中,AhR蛋白水平总体呈下降的趋势。2、AhR参与PPARγ的泛素化修饰。为研究AhR对PPARγ泛素化修饰的影响,发现CRL4BAhR介导的PPARγ泛素化修饰发生在细胞核内,并且AhR的激动剂3MC明显增强PPARγ泛素化水平。发现点突变(AhR F287A)和入核抑制剂(MDL-28170)降低PPARγ的泛素化水平。3、PPARγ的两个泛素化修饰位点为K268、K293,并且这两个位点的乙酰化和泛素化之间存在位点竞争。为了研究PPARγ的两个泛素化修饰位点,利用蛋白质质谱法筛选潜在的泛素化位点。根据质谱结果构建不同类型的突变型质粒,发现PPARγ上的两个赖氨酸被泛素化修饰,分别是K268、K293。这两个位点同时也是PPARγ乙酰化位点,通过加入去乙酰化酶的抑制剂NAM或敲低AhR,发现乙酰化和泛素化之间存在位点竞争。[研究结论]在CRL4B连接酶复合物中,AhR作为底物受体蛋白招募PPARγ,参与介导PPARy泛素化修饰。该泛素化修饰和蛋白质降解过程均发生在细胞核内,并且会受到其乙酰化修饰的影响。