目的　　研究负压伤口疗法 ( negative pressure wound therapy, NPWT ) 对小鼠烧伤感染创面愈合的作用，并基于全转录测序探讨其潜在相关作用的分子机制。　　实验方法　　1）构建小鼠背部烫伤感染创面模型，并随机分为治疗组和对照组， 24h后行切痂术，NPWT 组创面使用聚氨酯泡沫敷料覆盖创面并生物半透膜封闭、连接负压吸引，对照组聚氨酯泡沫敷料覆盖创面并生物半透膜封闭，不连接负压。观察指标如下：(1) 观察记录小鼠创面感染和愈合状况；(2) 采用多普勒血流仪检测第1、3、5、7天创面血流情况；(3) 取第1、3、5、7天小鼠创缘组织切片，HE染色观察小鼠创缘组织病理变化，免疫组化观察CD31、Ki67、VEGF和TGF-β1表达变化；(4) ELISA检测创缘组织中IL-1β、TNF-α、VEGF 和 TGF-β1含量。　　2）构建在体动物模型及随机分组方法同前，实验组给予NPWT治疗，对照组治疗同上，于治疗24小时之后收集创缘皮肤组织提取总RNA，检测合格后，进行转录组测序及生物信息学分析，基本步骤如下：(1) 使用Illumina HiseqXten对样品上机测序，对测序数据全基因组定位、基因结构分析、染色体定位分析以保证结果可信度，计算基因表达量，并筛选NPWT组与对照组的差异表达基因。(2) 根据circRNA结构特征，对样本中可能存在的 circRNA 进行预测，计算表达量并筛选差异表达。(3) 根据 mRNA 差异基因筛选结果，用 DESeq 算法进行差异基因筛选（DifGeneFinder），得到差异表达的lncRNA。(4) 从总RNA中分离纯化18-30nt的miRNA 分别在各 miRNA 的 3’ 和 5’ 端接头序列上用 T4 连接酶连接，然后通过RT-PCR 进行扩增，所得 miRNA文库进行测序分析并筛选差异表达基因。(5) 采用生物信息学的工具和方法对 NPWT 治疗后小鼠感染创面组织中差异表达基因进行本体功能分类、基因调控网络的构建、信号通路分析及网络构建、互作关系分析、circRNAs/lncRNAs-miRNAs-mRNAs 的靶标关系预测分析，筛选出可能在NPWT促进创面愈合中发挥关键作用的circRNAs, lncRNAs, miRNAs 和mRNAs并对分析筛选结果进行初步验证。　　实验结果　　1）在实验第1、3、5天，NPWT 组中标记菌荧光表达量均显著低于对照组（P＜ 0.01）；小鼠创面，第3天与对照组相比NPWT组面积即显著缩小（P＜ 0.05），该差异性至实验观察最后时间点第7天；创面血流，在实验第 3、5、7 天，与对照组相比NPWT组灌注量显著升高（P＜ 0.01）。创面组织HE染色结果显示，NPWT组中炎性细胞浸润数量与对照组相比显著降低（P<0.05）。免疫组化结果显示与对照组相比，NPWT组CD31，Ki67，TGF-β1，VEGF表达量均显著增加（P＜ 0.05）。ELISA结果显示， NPWT组创缘组织中TNF-α水平在伤后1、3、5天均显著低于对照组（P＜ 0.01）；NPWT 组中IL-1β的水平在实验过程中没有显著变化，对照组中IL-1β表达在实验开始前3天显著升高（P＜ 0.01）；NPWT组创缘组织中VEGF的表达量在实验第3天显著升高（P<0.01），并持续到实验结束，对照组在实验第3天后表达水平逐渐升高，但仍显著低于 NPWT 组；TGF-β1 表达水平在实验开始后第1天，NPWT 组即显著高于对照组（P＜ 0.01）并在实验第3天达到峰值。上述结果表明，NPWT 能促进创面愈合，并能引起广泛的生物学效应。　　2）通过 RNA-seq 技术成功构建了各样本的转录组，具体分析结果如下：(1) 得到864个显著差异mRNAs，其中上调610个，下调254个；预测到共有37个显著差异circRNAs， 12个上调和25个下调；108个显著表达差异lncRNAs， 68个上调，39个下调；67 个具有显著差异 miRNAs，其中37 个上调，30 个下调。(2) 通过生物信息学分析筛选出与miRNAs存在关系的差异显著的外显子型circRNAs有5个，与其存在 ceRNA 关系的 miRNAs 有 4 个，包括 mmu-miR-877-3p, mmu-miR-669m-5p, mmu-miR-1224-3p, mmu-miR-497a-5p，它们调控52个显著差异的 mRNA。分析显示这些基因功能集中在免疫反应、炎症应答、病毒防御等免疫功能相关的基因表型。筛选出差异显著的长度大于200bp lncRNAs有107个，GO 本体分析结果显示其与circRNAs的结果完全一致；而与这些lncRNAs存在ceRNA关系的 miRNAs 中有 3 个与 cricRNAs 也存在 ceRNA 关系，即 mmu-miR-669m-5p, mmu-miR-1224-3p, mmu-miR-497a-5p。故存在功能交集并受到circRNAs 和 lncRNAs共同调控的显著差异基因有 44 个 mRNAs，综上所述，经生物信息分析，课题组筛选出3个circRNAs、5个lncRNAs、3个miRNAs、44个mRNAs可能是NPWT 促进创面愈合中发挥关键作用的分子，功能集中在免疫反应、炎症应答、病毒防御等免疫功能相关的基因表型。通过对上述显著差异的 cricRNAs、lncRNAs、miRNAs和 mRNAs 等分子的表达情况进行 qPCR 实验验证，并对 mRNAs 编码的蛋白进行western blotting 实验验证。qPCR验证结果与测序检测结果一致，western blotting验证，确定TIFA、GLA、PLCB2、CD84及SLFN9等分子在实验组中出现显著上调，这与测序检测结果基本一致。　　结论　　1. 烧伤感染创面可引起小鼠创面局部组织中细菌增殖，炎性反应增高，血流灌注降低，阻碍创面愈合，NPWT 治疗可减轻创面局部感染，增加血流灌注，抑制抗炎因子表达，促进生长因子表达，加速创面愈合进程。　　2. 应用转录组测序技术，在构建小鼠转录组表达谱基础上，通过生物信息分析发 现 ， NPWT 可 能 是 通 过 mmu_circ_0004796, mmu_circ_0011322, mmu_circRNA_Hnrnpll, LOC102634528, LOC102639837, LOC102639918, 4930431P03Rik, Gm10782 调控mmu-miR-669m-5p, miR-1224-3p和miR-497a-5p 继而影响TIFA, GLA, CD300a, PLCB2, EIF2AK2, CD84, SLFN9, Lasp1, GDF11等的表达发挥促进创面愈合作用。