在多种碳源存在条件下,微生物优先利用优势碳源,而抑制非优势碳源的代谢以达到最佳生长状态,这种调控现象称之为碳代谢物抑制(CCR)。不同微生物中,CCR的调控系统及机制存有差异。假单胞菌(Pseudomonas)CCR系统主要由碳代谢物抑制蛋白Crc、双组份系统CbrAB及非编码RNA CrcZ等组成。全局性调控蛋白Crc在CCR调控中发挥核心作用。当优势碳源存在时,Crc蛋白与非优势碳源代谢途径靶基因mRNA结合抑制其表达;当优势碳源消耗殆尽时,非编码RNA与Crc结合解除CCR作用。目前,关于Crc蛋白的作用机制仍存有争议,其是否参与固氮调控也未见报道。施氏假单胞菌A1501(Pseudomonas stutzeri A1501)为一株根际联合固氮模式菌,其分离自碳源丰富、氮源缺乏的水稻根际环境。A1501基因组携带一套以Crc蛋白为核心的CCR调节系统,但调控机制尚不清楚。本文研究了施氏假单胞菌A1501的Crc蛋白在碳代谢物抑制、固氮及根际定殖过程中的生物学功能,并分析了Crc蛋白的作用机制。主要结果如下:1、Crc蛋白介导的碳代谢物抑制现象。生长能力测定发现,A1501菌在LB丰富培养基和以琥珀酸、乳酸钠为唯一碳源条件下生长迅速,而以葡萄糖、苯甲酸为唯一碳源时生长缓慢,表明琥珀酸、乳酸钠为A1501的优势碳源,葡萄糖、苯甲酸为非优势碳源。采用高效液相色谱分析LB加苯甲酸和乳酸钠加葡萄糖混合培养条件下野生型A1501和Δcrc突变株对非优势碳源的利用能力。结果显示,以LB加苯甲酸混合培养6 h,野生型对苯甲酸的代谢速率为8.111μmol/OD/h,而Δcrc对苯甲酸的代谢速率为23.278μmol/OD/h;以乳酸钠加葡萄糖混合培养12 h,A1501对葡萄糖的代谢速率为27.776μmol/OD/h,Δcrc对葡萄糖的代谢速率为73.418μmol/OD/h。可见,施氏假单胞菌A1501具有典型的CCR现象,Crc蛋白失活则显著缓和这种抑制作用,其在该菌的CCR过程中发挥关键调节功能。2、crc基因的表达特性及其对非优势碳源代谢基因表达的影响。qRT-PCR分析发现,当以苯甲酸为唯一碳源时,crc的转录水平显著低于以乳酸钠、琥珀酸、葡萄糖为唯一碳源时的表达;而在丰富型LB培养基中,crc基因的表达显著上调。相反,与有乳酸钠和LB存在的条件相比,非编码RNA CrcZ/Y的表达在以苯甲酸或葡萄糖为唯一碳源时受到强烈诱导。并且Dual-crcZ/Y双突变株不能利用葡萄糖生长。此外,以LB加苯甲酸混合培养时,Δcrc中苯甲酸降解途径特异激活子BenR翻译水平为野生型的2倍,苯甲酸降解基因benA与转运体编码基因benK转录水平显著提高;在乳酸钠加葡萄糖混合碳源条件下,Δcrc葡萄糖代谢关键酶的编码基因(edd、zwf)及其调节子GltR表达水平与野生型相比显著上调;暗示着当优势碳源存在时,Crc蛋白可能通过调控特异调节子、关键代谢酶及转运体等编码基因的表达以多层次、多靶点的策略抑制A1501对非优势碳源的吸收。以上结果说明该菌的CCR系统能够响应营养信号调控碳代谢网络的表达,同时胞内自由Crc蛋白库的水平可能受非编码RNA CrcZ/Y浓度变化的调节。3、Crc蛋白对氮代谢和竞争定殖相关生理过程的影响。固氮酶活结果显示,以乳酸钠为唯一碳源条件下,Δcrc固氮活性仅为野生型A1501的50%。通过qRT-PCR和免疫印迹实验发现,与野生型相比,Δcrc中固氮基因nifHDK转录水平与蛋白水平均显著下调。以上结果表明Crc蛋白失活导致A1501固氮能力显著降低。其次,研究发现crc基因缺失显著影响了A1501的反硝化能力,在绝对厌氧、以硝酸盐为唯一氮源条件下,Δcrc生长能力显著低于野生型;而以亚硝酸盐为唯一氮源时,突变株不能生长。此外,水稻根表竞争定殖实验显示,Δcrc根表定殖菌落数不足野生型的1/2。同时,crc基因的缺失导致菌体运动能力、氧化胁迫和渗透压胁迫抗性严重受损。由此可知,除了介导CCR机制,Crc蛋白在氮代谢、根表定殖、趋化运动等生理过程中发挥重要的正调控作用。4、Crc蛋白对相关基因调控的作用机制。序列分析发现,与苯甲酸代谢、葡萄糖代谢、固氮、反硝化、运动及氧化抗性相关的一些基因mRNA序列存在Crc蛋白保守结合序列AANAANAA。但保守识别序列位置分布有差异:Crc蛋白负调控的碳代谢靶标保守结合序列位于翻译起始位点附近,其正调控的氮代谢等途径靶序列位于基因内部。利用微量热涌动技术(MST)未检测到Crc蛋白与靶RNA的体外结合,但Crc蛋白可与RNA分子伴侣蛋白Hfq、靶RNA形成紧密的三元复合体。Hfq蛋白与crcZ、benA及nifH的亲和力分别为14.2 nmol/L、36.9 nmol/L及365.0 nmol/L,而Crc蛋白的加入可提高亲和力至7.9 nmol/L、12.6 nmol/L及66.5 nmol/L。以上结果表明,在Hfq蛋白辅助下,Crc蛋白可与苯甲酸代谢基因、葡萄糖代谢基因及固氮基因等相关靶mRNA结合调节靶标基因的表达从而调控相应代谢途径的活性。综上所述,Crc蛋白是施氏假单胞菌A1501碳代谢物抑制作用的关键调控因子,其可通过与Hfq蛋白协同结合于靶标RNA的AANAANAA保守识别序列抑制靶基因的翻译从而调控靶标代谢途径的活性,以保证A1501在复杂多变的根际环境中高效利用碳源满足各种生理活动的需要。同时,该蛋白可能通过直接作用正调控A1501的固氮、反硝化、运动、定殖等过程。本研究提出了施氏假单胞菌A1501以Crc蛋白为核心的碳代谢物抑制调控机制及全局调控的理论模型,有助于理解该菌在竞争激烈的根际环境如何保持代谢高效性、获得竞争优势,为进一步研究假单胞菌的碳氮偶联与全局调控机制奠定了理论基础。