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肌分化因子（Myogenic Differentiation 1,MyoD1）属于生肌调节因子（MRFs）家族的成员之一,是细胞成肌分化、肌纤维形成等阶段中的重要调控因子。肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）主要在骨骼肌中特异性表达,对人类和动物肌肉生长、脂肪沉积等有重要作用。DNA甲基化（DNA Methylation）为DNA的表观性遗传调控的一种形式,也是目前最早发现的一种修饰DNA方法之一,在不需要改变DNA序列的前提下,改变DNA的遗传表征,在DNA甲基转移酶的作用下稳定传给子代DNA。本实验以关岭牛为研究对象,运用组织特异性表达检测、单接头文库扩增测序（高通量测序）、原代细胞培养、免疫荧光法细胞鉴定、5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’deoxycytidine,5-Aza-d C）处理、CCK8检测、细胞周期检测、细胞凋亡检测等方法,从分子和细胞水平,探究DNA甲基化对MyoD1、MSTN基因表达影响及对关岭牛成肌细胞增殖的影响。主要研究结果如下:1.MSTN、MyoD1及DNMT1在不同肌肉组织中的表达情况采用qRT-PCR分析不同肌肉组织中MSTN、MyoD1及甲基化转移酶DNMT1表达量差异。MSTN基因在关岭牛胚胎牛中达量分别为腰大肌>背最长肌>前腿肌>后腿肌;在成年关岭牛为腰大肌>后腿肌>背最长肌>前腿肌;而MyoD1基因在背最长肌的表达量最高,其表达量分别为背最长肌>前腿肌>腰大肌>后腿肌,成年关岭牛背最长肌也是表达量最高,其表达量分别为背最长肌>后腿肌>前腿肌>腰大肌;DNMT1基因在后腿肌表达量最高,其表达量为后腿肌>前腿肌>腰大肌>背最长肌,在成年关岭牛中则是前腿肌表达量最高,其表达量为前腿肌>背最长肌>腰大肌>后腿肌。2.MyoD1基因启动子区甲基化检测及甲基化位点筛选通过生物信息学分析,在MyoD1基因启动子区域（-781bp-+67 bp）预测出Cp G-1、Cp G-2、Cp G-3三个Cp G岛,大小分别为120bp、100bp、104bp,以及转录因子有ZSCAN29、ZNF449、ZNF740、ZNF75D、ZNF460、ZSCAN4。采用单接头文库扩增测序（高通量测序）的方法,检测关岭牛胚胎牛及成年牛（24月）背最长肌中MyoD1基因启动子区甲基化水平,检测发现关岭牛Cp G、CHG、CHH均有甲基化发生,胚胎牛为15.4%、1.4%、0.8%,成年牛为20%、1.1%、1.2%。胚胎牛背最长肌中MyoD1基因甲基化水平极显著低于成年牛（P<0.01）,Cp G-1有三个高甲基化位点（P>0.49）分别为Cp G-1-1、Cp G-1-2、Cp G-1-3。胚胎牛甲基化率53.16%、49.36%、52.31%,成年牛甲基化率56.20%、54.24%、61.73%,且均属于Cp G-1。而在非Cp G岛区域Else-2存在一个甲基化位点Else-2-1,Else-1没有甲基化位点。3.5-aza-d C对关岭牛成肌细胞增殖及MyoD1基因启动子区甲基化水平影响本实验在关岭牛成肌细胞中添加不同浓度的5-aza-d C后,发现0.1μmol/L 5-aza-d C处理组适合用于后续实验。0.1μmol/L5-aza-d C处理48 h时,细胞凋亡率较空白组极显著增加（P<0.01）,促进细胞凋亡。为进一步检测5-aza-d C是否与Bcl、Bax、Caspase-9等细胞凋亡因子有关,通过qRT-PCR检测,发现0.1mo L/L5-aza-d C处理细胞后能够极显著降低细胞抗凋亡因子Bcl的表达量（P<0.01）,提高促凋亡因子Bax表达,显著提高促凋亡因子Caspase-9的表达（P<0.05）。同时通过流式细胞仪检测5-aza-d C处理组细胞及空白组细胞,发现0.1mo L/L5-aza-d C处理组G0/G1期细胞比高于空白组,但差异不显著（P>0.05）,S期及G2/M期细胞低于空白组,但差异不显著（P>0.05）。为进一步检测5-aza-d C对细胞周期相关因子Cyclin B1、Cyclin A2、Cyclin D表达影响,通过qRT-PCR检测相关细胞因子的表达,发现5-aza-d C显著提高了周期因子Cyclin A2的表达（P<0.05）,对细胞因子Cyclin B1、Cyclin D表达差异不显著（P>0.05）,同时检测甲基化水平,发现空白组的MyoD1启动子区Cp G甲基化率为28.0%,CHG甲基化率为2.0%,CHH甲基化率为1.9%,实验组的MyoD1启动子区Cp G甲基化率为19.8%,CHG甲基化率为1.3%,CHH甲基化率为1.8%;0.1 mo L/L5-aza-d C处理实验组极显著降低MyoD1启动子区的甲基化率（P<0.01）。在Cp G-1中甲基化位点Cp G-1-1、Cp G-1-2、Cp G-1-3、Cp G-1-4甲基化率显著降低,Cp G-2、Cp G-3中甲基化率在处理前和处理后没有较大差异且都低于49%,非Cp G岛区域Else-1、Else-2甲基化位点甲基化水平均低于49%,进一步筛选出甲基化位点。4.MyoD1启动子区Cp G-1及ZNF449载体的构建通过PCR等方法克隆了MyoD1启动子区Cp G-1和ZNF449,并成功构建了p GL-3-Basic-Cp G-1;pc DNA3.1（+）-ZNF449真核表达载体。综上所述,关岭牛胚胎牛背最长肌中MyoD1启动子区甲基化水平极显著的低于成年牛（P<0.01）,以及MyoD1启动子区甲基化对MyoD1基因的表达呈负调控;5-aza-d C通过调节Caspase-9、Bcl、Bax和Cyclin A2 m RNA表达水平影响牛成肌细胞的增殖和凋亡;0.1μmo L/L5-aza-d C极显著降低关岭牛成肌细胞中MyoD1启动子区甲基化水平（P<0.01）,同时极显著增加MyoD1基因m RNA的表达量,显著降低了MSTN基因m RNA的表达量（P<0.05）。