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本课题组前期研究中与美国洛克菲勒大学附属艾伦-戴蒙德艾滋病研究中心(ADARC)及国际艾滋病疫苗行动组织(IAVI)合作已经成功构建了针对中国HIV-1C/B’亚型的DNA疫苗和重组MVA疫苗。其中重组MVA疫苗基因组中携带有HIV-1 C/B’CRF株三个结构基因gag-pol、env和两个调节基因nef-tat共5个外源基因,得到的重组MVA疫苗,命名为ADMVA疫苗。本论文在以上的基础上,参照2005年中华人民共和国药典和其他疫苗类生物制品的检测方法以及“预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指导原则”,结合重组MVA病毒自身的特性,从以下几个方面对ADMVA疫苗质控方法进行了初步研究,拟定了相关的质量标准。应用免疫酶技术对ADMVA疫苗感染性滴度进行检测,并对此方法的敏感性及重复稳定性进行验证。取5组重组MVA病毒样品,同时应用免疫酶技术和传统的CPE两种方法进行检测,同一组病毒样品免疫酶技术测得的病毒感染性滴度略高于CPE法,直线回归分析显示两种方法测得的结果之间存在直线关系(b=1.046,t=45.244,P＜0.001),线性相关分析显示两种方法测得的结果呈正相关(r=0.999,P＜0.001),说明免疫酶技术敏感性较好;随机选出两组病毒样品MVA-01、MVA-02,由不同的实验人员在不同时间应用免疫酶技术重复检测7次,MVA-01组病毒样品7次检测所得平均病毒感染性滴度为6.08 lg IFU/ml,板内变异系数为3.26%;MVA-02组病毒样品平均病毒感染性滴度为6.17 lgIFU/ml,板内变异系数为2.87%,说明免疫酶技术重复稳定性较好。为了验证重组MVA病毒在哺乳动物细胞内抗原表达的正确性,用扩增得到的重组MVA病毒感染CEF(鸡胚成纤维细胞),进行Western Blotting(免疫印迹)检测,建立体外效力检测方法。HIV结构蛋白Gag、Pol和Env蛋白在哺乳动物细胞中都得到较好的表达,这样就在蛋白水平上证明了插入基因和表达框架的正确性,重组MVA病毒所表达的HIV结构蛋白能够被中国流行株C/B’(区域性)的抗血清所识别,说明经过改良修饰后的基因在抗原性上与对应的病毒株一致。进行初步的小鼠免疫试验。首先利用BCA法测定本实验室保存的Gag蛋白浓度,在0倍到500倍稀释度之间,浓度与OD值是线性相关的,R~2=0.9952,说明相关性较好,直线回归方程:Y=0.0012X+0.005,得出总蛋白浓度为809μg/ml。Gag蛋白作为包被抗原,通过酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)来检测免疫小鼠血清中针对HIV Gag蛋白的特异性中和抗体的效价,并建立该重组疫苗诱导的体液免疫反应检测的质量控制方法。采用酶联免疫斑点方法(Enzyme Linked ImmunoSpot,ELISPOT)来评价重组疫苗刺激机体产生的细胞免疫反应,ADMVA接种BALB/c小鼠后,对小鼠脾淋巴细胞进行ELISPOT检测IFN-γ水平,用以衡量小鼠体内针对所插入的HIV-1 env,gag,pol和nef四个基因片段的肽段特异性的T细胞应答水平,评价细胞免疫反应的强弱,建立相应的质量控制方法。