化脓隐秘杆菌是一种条件性致病菌,主要定植于动物黏膜表面,能够引起家畜乳腺炎、子宫内膜炎等多种疾病,给养殖业造成严重的危害。抗菌药物是治疗化脓隐秘杆菌所致疾病的重要治疗手段,然而由于抗菌药物的不合理使用,导致化脓隐秘杆菌耐药性日益增强。多药耐药家族蛋白(MarC)是一种跨膜蛋白,在物质的转运过程中发挥重要作用,研究化脓隐秘杆菌marC基因的生物学功能,将有助于揭示化脓隐秘杆菌耐药机制和致病机理,为防治化脓隐秘杆菌所致疾病提供依据。本研究以本实验室保存的化脓隐秘杆菌野生株为研究对象,以marC基因的上下游片段作为同源重组的同源片段连接到穿梭载体pBAV1K-T5-gfp上,构建重组质粒pBAV1K-T5-gfp△marC;使用电转化法将重组质粒pBAV1K-T5-gfp△marC转入化脓隐秘杆菌感受态细胞中,通过传代使质粒丢失后筛选出marC基因缺失株,采用PCR和基因组测序的等方法鉴定marC基因缺失株;对比marC基因缺失前后对化脓隐秘杆菌生长、耐药、生物被膜和形态以及转录水平的变化。重组质粒的PCR与双酶切均表明重组质粒构建成功,其测序结果表明重组质粒上的同源片段与化脓隐秘杆菌野生株基因组中的marC基因的上下游片段之间无碱基突变,可用于后续的同源重组;PCR鉴定疑似化脓隐秘杆菌敲除株的marC基因,以上游同源臂的上游引物和下游同源臂的下游引物组合进行PCR扩增并测序,结果得到1818 bp大小的目的条带,与原菌株的2439 bp相比,缺少621 bp的marC基因,对疑似marC基因缺失株的基因组测序,未发现有marC基因,因此化脓隐秘杆菌野生株的marC基因缺失株构建成功;试验结果表明marC基因对化脓隐秘杆菌的生长和最小抑菌浓度无影响;采用结晶紫染色法对化脓隐秘杆菌的生物被膜形成能力进行定量分析,结果表明marC基因缺失后生物被膜形成能力显著降低,对已经形成的生物被膜中的活死细菌染色发现marC缺失菌株细菌总量减少,且死细菌比例增多;转录组分析结果表明,与生物被膜形成相关的rbsB、marR、moxR基因的mRNA表达量均显著上调,且多药耐药外排家族蛋白中的能量依赖性ABC转运家族蛋白、SNF家族转运蛋白表达量均显著上调。推测,marC基因缺失导致生物被膜形成能力显著降低可能是由于rbsB、marR、moxR基因的mRNA表达量显著上调导致的。转录组学差异表达基因分析得到66个差异表达基因,23个差异表达基因下调,43个差异表达基因下调。富集得到4条差异表达代谢通路,其中与耐药相关的ABC转运代谢通路表达量上调且差异极显著。