论文部分内容阅读
漆酶是一种多铜氧化酶,多以基因家族形式存在,编码不同活性的同工酶,参与真菌形态建成、宿主与病原互作、合成色素、应激反应等多种重要生物学过程,但由于漆酶家族成员众多及作用底物范围广泛,对其功能的阐释多为表型分析,对漆酶参与的生化途径了解较少。玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）是一种半活体子囊真菌,可以侵染玉米、高粱等作物,形成梭形病斑,影响植物光合作用从而降低产量。前期研究发现,玉米大斑病菌漆酶基因StLAC1、StLAC2影响病菌生长、发育及致病,本论文对玉米大斑病菌漆酶家族基因进行了系统鉴定,并在转录及蛋白水平上寻找关键基因,结合基因组学、代谢组学研究玉米大斑病菌中关键漆酶基因在病菌生长、发育及致病中的功能。得到以下结果:1.利用多铜氧化酶结构域的隐马尔可夫模型,在玉米大斑病菌基因组中鉴定得到了9个漆酶样多铜氧化酶,均含有保守的铜离子结合特征序列,但其蛋白氨基酸序列同源性低,仅为19.79%-48.70%,聚类在5个不同的超家族,其中Stlac1、Stlac2、Stlac4、Stlac6为子囊菌多铜氧化酶。在9个基因上游含有正向氮调控基因作用元件（NIT2）、正向调控过氧化物酶体蛋白基因作用元件（ADR1）、异物质响应元件（XRE）、负责碳代谢产物阻遏的元件（CRE-A）等多个顺式作用元件。利用转录组数据分析发现,玉米大斑病菌01-23菌丝中StLAC2、StLAC6的基因表达量最高,StLAC3较高,其余基因表达量均相对较低。漆酶家族蛋白酶活性和基因转录水平均受培养时间、碳源、氮源、铜离子、铁离子的影响,且在侵染的早期、中期和后期差异表达,除了StLAC6和StLAC8的表达量下降,其他基因在不同时期相对表达量均增加。2.利用Native-PAGE及MS检测玉米大斑病菌01-23中漆酶同工酶谱,发现Stlac1、Stlac2及Stlac6为主要表达的活性蛋白,其中Stlac2主要在胞内表达,Stlac1和Stlac6在胞内、胞外均可以检测到。在原核宿主Escherichia coli Rossetta中诱导表达以上蛋白,通过对IPTG浓度、诱导温度、初始菌液浓度、转速及铜离子进行优化,最终分离得到重组同工酶Stlac1、Stlac2及Stlac6,酶活分别为:1.058 U/mg、0.861U/mg和0.028 U/mg。对其酶学性质进行分析发现,重组漆酶均具有较低的最适pH（3-4.5）及较高的最适温度（60-70℃）,金属离子对酶活的影响不同,但Fe3+对3种同工酶酶活都具有较强的激活作用。同时在真核宿主Pichia pastoris KM71H中表达的重组漆酶Stlac2活性丧失,推测其可能原因为Asn97位的不正确的糖基化导致。3.利用原生质体转化创制关键漆酶基因StLAC6基因敲除突变体,获得两个突变菌株,对其表型分析表明,StLAC6基因的缺失对病菌生长、形态、产孢及侵染能力并没有影响,但基因缺失后导致其对玉米感病品种致病性增加,粗毒素使叶片伤口褐化,黑色素合成增加,过氧化物酶体增加且形态异常,脂质体及产生的酚类物质含量增加。StLAC6基因的缺失导致StLAC1、StLAC4和StLAC5基因相对表达显著增加,同时影响StLAC6的邻近基因的表达,包括N乙酰转移酶、细胞色素P450单加氧酶及磷脂代谢相关的酶类的相关编码基因等。4.对玉米大斑病菌菌丝的代谢物提取方法进行了优化并利用超高效液相色谱串联飞行时间质谱对野生型菌株、ΔStLAC1、ΔStLAC6进行代谢组分析及化合物结构解析,结果显示,与野生型菌株相比,两个同工酶缺失引起病菌代谢物明显变化,StLAC1基因缺失引起的差异代谢物更多且大多数为其所特有的,而StLAC6基因缺失导致的差异代谢物多数是在两个突变体中共同变化的。利用ELISA酶联免疫检测定量测定了不同菌株中差异代谢物植物鞘氨醇、前列腺素PGE2和真菌毒素相关代谢物玉米赤霉醇、桔霉素等次级代谢产物含量,与代谢组学结果一致。5.代谢组学分析表明,同工酶Stlac1和Stlac6参与脂质及芳香类化合物尤其是聚酮化合物的合成,其中StLAC6基因缺失导致镰孢红素酮、桔霉素、双孢菌素等真菌毒素含量增加,影响真菌致病性;StLAC1缺失主要影响磷脂及类固醇类化合物合成,从而影响致病性及病菌形态;部分前列腺素类化合物在2个漆酶同工酶突变体中变化趋势相反。通过蛋白与差异代谢物分子对接及荧光滴定法证实,前列腺素PGE2和桔霉素是Stlac6的天然底物,核黄素是Stlac1的天然底物,漆酶直接参与其代谢途径;而漆酶不直接作用于磷脂及脂肪酸,但缺失引起磷脂及脂肪酸类等代谢物的变化,通过信号转导途径最终实现对病菌形态、黑色素合成及致病性的影响。