研究背景与目的动脉粥样硬化易损斑块及其并发症是危害人类健康的“头号杀手”。易损斑块(Vulnerable Plaque)不可预测的突然破损或侵蚀、血小板激活和血栓形成造成血管迅速闭塞是引发心肌梗死、脑血栓等突发致死性和非致死性心脑血管事件最重要的发病机制,其中动脉粥样硬化易损斑块的破裂又被视为最重要的始动环节。然而,动脉粥样硬化斑块的发生发展是个隐匿的慢性过程,大部分心脑血管事件发作前都没有先兆表现。因此,早期识别动脉粥样硬化易损斑块,进而指导早期的干预治疗,对于避免或延缓事件的发生有着十分重要的临床意义。但是目前临床尚无早期识别和检测动脉粥样硬化易损斑块的有效手段。随着靶向分子成像技术的新兴和发展,现有的许多无创影像手段,如：超声、核素(PET)、MRI和CT等均在对易损斑块评价进行积极的分子水平探索。其中,靶向超声分子成像(Ultrasound Molecular Imaging, UMI)是将靶向病变组织特定分子的特异性配体连接于超声微泡表面,构建成靶向超声微泡,以其作为分子探针,采用增强对比超声(Contrast Enhanced Ultrasound, CEU)的方法对粘附在血管内皮细胞上的特异分子进行分子水平超声显影,从而实现疾病分子水平上特异性诊断的目的。与其他的传统影像技术相比,超声分子成像技术具有实时、高空间及时间分辨率、无放射污染、仪器便携和价廉等优点。它是在体评价血液循环内固定的分子靶点时空变化和特征的理想方法,特别适合对斑块炎症反应和动脉血栓形成时分布在血管内皮和活化血小板上的分子靶点进行在体定位、定量和可视化。目前,国际上已有研究者成功实现了UMI靶向动脉粥样硬化斑块内皮细胞表面上的分子靶点,主要包括：靶向血小板粘附的活化的血管假性血友病因子(von Willebrand Factor, vWF),靶向炎症的血管细胞粘附因子-1(Vascular Cell Adhesion Molecular-1, VCAM-1)和P-选择素,靶向新生血管的血管内皮生长因子受体-2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2,VEGFR-2)和白介素-8；而迄今为止,UMI靶向活化血小板和血栓来检测动脉粥样硬化表型的研究尚未见报道。然而,易损斑块内皮上的活化血小板和血栓在动脉粥样硬化斑块的发生发展方面扮演着非常重要的角色,并且与动脉斑块的易损性(Vulnerability)密切相关；再者,动脉粥样硬化血栓是无症状的、隐匿的,其可以作为高风险易损斑块的预警信号,并可以通过UMI靶向活化血小板检测到。因此,UMI靶向“斑块内皮上的活化血小板”,无疑可为临床检测动脉粥样硬化易损斑块并对其进行危险分层提供非常有价值的手段,进而指导干预治疗,避免或延缓急性心脑血管事件的发生。血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体(Glycoprotein Ⅱb/Ⅲa, GP Ⅱb/Ⅲa),亦称αⅡbβ3整合素,是高度表达于活化的血小板表面的主要受体,亦是血小板活化的一种生物标志,其可与纤维蛋白原等多种粘附蛋白的RGD序列(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸,Arg-Gly-Asp)的结合位点结合,是动脉粥样硬化血栓形成过程中血小板与其它血小板以及毗邻细胞之间相互作用的必需条件,更是各种因素致血小板聚集和血栓形成的最终共同通路。有研究报道,急性冠脉综合征或不稳定型心绞痛患者血液循环中血小板聚集和循环血小板表面的GP Ⅱb/Ⅲa受体的表达情况明显高于稳定型心绞痛患者或健康志愿者。因此,GP Ⅱb/Ⅲa受体是显影动脉粥样硬化斑块中聚集血小板的一个潜在的标志,可作为血栓检测及临床抗凝治疗中一种重要的靶向分子。然而,晚期动脉粥样硬化病变中血小板上GP Ⅱb/Ⅲa受体表达与斑块严重程度之间的相关性方面的研究数据是很有限的,而且活化血小板表面的GP Ⅱb/Ⅲa受体是否能够作为高风险斑块的生物标志是不清楚的,这亦是本研究首要解决的问题。含RGD序列的寡肽对GP Ⅱb/Ⅲa受体具有较高的粘附性,已有研究将RGD序列线性寡肽连接在超声微泡表面,通过靶向微泡与血栓中活化的血小板GP Ⅱb/Ⅲa受体特异性结合,成功实现了深静脉、心房血栓的靶向超声分子成像。然而由于动脉内存在高剪切应力和“轴流”特性,实现动脉血栓的靶向分子显像则需要靶向结合能力更强的微泡。有研究表明,人工合成的RGD环寡肽序列能够模拟人体内源性RGD结合位点,使其在动脉粥样硬化动脉较大血流的情况下,比含RGD序列的线性寡肽结合GPⅡb/Ⅲa受体的能力高30倍。目前,我们课题组已成功构建出携带环RGD寡肽的靶向超声微泡,并通过体内和体外实验验证了其对GPⅡb/Ⅲa受体的粘附能力,进而实现了大动脉血栓的分子成像。但是上述实验研究中所采用的大动脉急性血栓模型构建方法均未能接近体内动脉粥样硬化斑块血栓形成的病理机制,并不能反应动脉粥样硬化斑块的发生、发展及演变过程。因此,本研究应用载脂蛋白E敲除(ApoE-/-)的小鼠建立了一种真正的动脉粥样硬化斑块的动物模型,为研究UMI识别易损斑块的研究提供了模型基础。因此,本研究应用C57BL/6野生型和ApoE-/-小鼠建立不同梯度的小鼠动脉粥样硬化斑块模型。分别应用组织病理学、扫描和透射电镜方法、免疫荧光等方法,探讨动脉斑块内皮上活化血小板表面的整合素GP Ⅱb/Ⅲa受体是否能够作为动脉粥样硬化斑块不稳定性的一个生物标志及其可能的机制；并通过CEU结合靶向超声微泡(MB-cRGD),对斑块内皮上活化血小板表面的GP Ⅱb/Ⅲa受体进行定量,进而识别易损斑块,以期为临床提供一种无创、有效识别和评价易损斑块的新方法。方法1、超声微泡的制备及理化性质鉴定将各种相关脂质材料与人工合成的磷脂环五肽或分子量相当、结构相似的同型非特异性多肽按一定比例加入20 ml蒸馏水中,在75℃水浴条件下使其完全溶解后,通入全氟丙烷气体(C3F8),使用高速剪切仪将其剪切至形成乳白色液体制备靶向超声脂质微泡(MB-cRGD)和同型对照非靶向微泡(MB-CON),静置、洗涤、纯化3次。制备及纯化后的微泡均置于冰箱中4℃C保存备用。显微镜观察微泡形态,并采用库尔特计数仪检测微泡的粒径大小及浓度。2、小鼠不同梯度动脉粥样硬化斑块模型的制备及分组应用C57BL/6野生型和ApoE-/-小鼠建立不同梯度的小鼠动脉粥样硬化斑块模型和对照模型,6周龄的C57BL/6和ApoE-/-雄性小鼠,分别给予普通饮食或者高胆固醇饮食(hypercholesterolemic diet, HCD,21%脂肪和0.25%胆固醇),持续喂养30周时,各组随机选取3只小鼠,分离其腹主动脉大体标本,进行油红O染色大体染色,观察各组小鼠动脉斑块的情况。动物分组为：C57BL/6小鼠普通饮食组(C57BL/6+chow)、C57BL/6小鼠高胆固醇饲养组(C57BL/6+HCD)、ApoE-/-小鼠普通饮食组(ApoE-/-+chow)、ApoE-/-小鼠高胆固醇饲养组(ApoE-/-+HCD)。3、体内荧光验证血小板粘附于主动脉斑块内皮表面通过心脏采血法分别取C57BL/6野生型小鼠的全血,0.129M枸橼酸钠抗凝后经离心法提取浓缩血小板并制备血小板混悬液。制备的血小板混悬液与钙黄绿素-AM(Calcein-AM,300ng/ml)暗处孵育15min后,经尾静脉留置针随机分别注入以上4组(n=6)不同小鼠体内；另外,分别注入相同体积的不含血小板的钙黄绿素-AM和不含钙黄绿素-AM的PBS液体至ApoE-/-+HCD小鼠体内,作为阴性对照(n=6)和荧光对照组(n=6)。注入15min后,处死各组小鼠,收集腹主动脉,快速冰冻切片,置于普通光学及荧光显微镜下观察孵育后的血小板在各组小鼠腹主动脉斑块内皮表面的粘附情况。4、电镜检测活化血小板和动脉斑块情况靶向超声分子成像图像采集结束之后,从四种梯度斑块模型组的小鼠中各自随机取6只,取小鼠的腹主动脉样本置于2.5%戊二醛溶液固定4h后,经过标准流程处理后,行电镜观察。采用扫描电镜(工作电压20千伏)观察不同组小鼠腹主动脉管腔内表面上活化血小板的粘附情况,并人工计算10个视野(每个视野25.5x25.2 mm)中血小板的数量。此外,利用透射电镜(工作电压80千伏)检查ApoE-/-+HCD小鼠组腹主动脉组织内活化血小板的情况。5、HE、Masson和免疫组化染色检查靶向超声分子成像图像采集结束后,四种梯度斑块模型组内各自剩余的小鼠(n=6),取小鼠腹主动脉组织经固定、脱水、石蜡包埋后做成3μm厚的石蜡切片,分别行HE、Masson染色和免疫组化染色。6、斑块组织病理学相关指数的定量每个动物的腹主动脉的HE、Masson以及免疫组化做完之后,通过面积法分别测量每个切片中的脂质沉积和胶原纤维,用占据整个面积的百分比来表示。免疫组化的阳性面积采用IPP软件分析,表示为占整个斑块或血管面积的百分比。斑块中平滑肌细胞和巨噬细胞的含量表示为占整个斑块面积的阳性百分率。斑块中GP Ⅱb/Ⅲa受体的测量方法有两种：GP Ⅱb/Ⅲa受体在在整个斑块中的表达百分率和GP Ⅱb/Ⅲa覆盖整个内皮的百分比。所有的数据测量和UMI、扫描电镜、组织学以及免疫组化的分析都是让两个对本实验设计不清楚的人进行的。动脉斑块的核/帽比值：即指通过HE、Masson可以计算出动脉斑块中脂质坏死中心的大小(necrotic core, NC)以及纤维帽(fiber cap, FC)大小,然后计算其NC与FC比值,可得到NC/FC比值；动脉斑块的易损指数：通过计算(巨噬细胞的含量+脂质沉积含量)/(平滑肌细胞含量+胶原纤维含量)的比值,即可得到斑块的易损指数。7、构建内皮细胞炎症模型和人血小板的分离培养以及免疫荧光检测人的脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell, HUVEC)株经传代培养种于共聚焦培养皿中,利用不同浓度梯度的肿瘤坏死因子-α (Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)刺激HUVEC, 1h后,通过细胞免疫荧光方法,检测HUVEC 上 vWF的表达情况；选取健康成年的志愿者(采血10天前未服用过任何药物),通过肘部正中静脉采血法,各自分别取20m1全血,0.129M枸橼酸钠(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)抗凝后,经200×g离心10min获取富血小板血浆,经高速离心(1000×g) 15min纯化、清洗2次,低速离心(120×g) 3min去除红细胞碎片,纯化的血小板用完全培养基重悬后种于共聚焦培养皿培养备用。利用不同浓度梯度的vWF刺激血小板,1h后,通过血小板免疫荧光方法,检测血小板上GP Ⅱb/Ⅲa的表达情况。8、小鼠腹主动脉靶向超声分子成像及图像分析动物模型制备后,各组随机取12只小鼠将其各自均分为实验组(n=24)和封闭组(n=24)。用支架固定超声探头(15L7)于小鼠腹主动脉部位上方,调整探头位置获得良好的腹主动脉长轴切面后保持位置不变,且仪器的各项参数在整个实验过程中不变。CEU检查采用二次谐波成像(second hannonic imaging)技术进行,探头发射和接收频率分别为7.0和15MHz,机械指数(Mechanical Index,MI)为0.18,超声发射间隔时间设定为10s。0.1ml的MB-cRGD和MB-CON数量约1×106个,经尾静脉弹丸式随机(间隔30min)先后注入到实验组或封闭组的每亚组小鼠体内。其中封闭组小鼠在微泡注入前经尾静脉给予18ug/g依替巴肽以饱和整合素GP Ⅱb/Ⅲa受体。注入微泡后行CEU连续观察10min并取图后给予高MI (MI=1.9)的连续脉冲破坏3s后取本底图像,所有图像均测量声强度(video intensity, Ⅵ)均采用MCE2.7彩色编码软件进行彩色编码处理,并对超声分子成像的VI值进行定量分析。9、统计学分析方法所有实验数据都以均数±标准差表示,使用SPSS13.0统计分析软件行统计学分析,差异性检验水准均设为p<0.05(双侧)。两组间的比较采用独立样本t检验；只有一个分组因素的多组比较,若方差齐,采用单向方差分析,组间多重比较采用Bonferroni法；若方差不齐,则选用近似F检验Welch法进行方差分析,组间比较则采用Dunnett’s T3检验。有3个分组因素的多组间比较采用析因设计的方差分析,非正态分布的两个变量之间的相关分析采用Spearman相关分析。结果1、超声微泡的特性采用高速剪切法制备的MB-cRGD、MB-CON在显微镜下观察均为透亮微气泡,大小形态一致。采用库尔特计数仪测得MB-cRGD和MB-CON的平均粒径分别约为2.52±0.28μm和2.54±0.30μm,浓度分别约为(1.13±0.19)×109/ml和(1.12±0.22)×109/ml。两种微泡的粒径和浓度并无统计学差异(p>0.05)。2、动脉粥样硬化斑块模型的制备情况四组小鼠的油红O染色结果显示,ApoE-/-+HCD组小鼠的腹主动脉可见较明显的动脉粥样硬化斑块形成,其后是ApoE-/-+chow组,C57BL/6+HCD组小鼠的腹主动脉仅有少量被染成红色的脂纹形成,C57BL/6+chow组小鼠的腹主动脉血管上未见粥样硬化斑块形成。3、体内荧光验证血小板粘附于主动脉病变内皮表面新鲜提取的血小板与calcein.AM暗处孵育后,荧光显微镜下观察血小板呈现绿色荧光。荧光标记的血小板经尾静脉注射到各组小鼠体内,冰冻切片于荧光显微镜下观察荧光血小板粘附于动脉粥样硬化病变处；四组小鼠中,ApoE-/-+HCD组的病变处粘附的荧光血小板的数量最多,其后依次是ApoE-/-+chow组,C57BL/6+HCD组,C57BL/6+chow组小鼠(p<0.05)。同时,阴性对照组(单纯注入不含血小板的calcein-AM溶液)小鼠或荧光对照组(仅注入PBS溶液)小鼠的动脉粥样硬化病变内皮上均未见到荧光血小板。4、电镜观察活化血小板粘附和聚集于动脉斑块上扫描电镜观察管腔内皮表面上聚集的血小板情况,ApoE-/-+HCD组小鼠动脉粥样硬化病变处募集了较多的血小板,而且这些血小板之间相互粘附聚集在一起。类似于体内荧光验证的结果,四组小鼠中,ApoE-/-+HCD组小鼠的管腔内皮处粘附的血小板的数量最多,其后依次是ApoE-/-+chow组,C57BL/6+HCD组,C57BL/6+chow组小鼠(p<0.05)。因为血小板的大小变化比较大(1-8μm),因此用扫描电镜根据它的大小来确定血小板是不足充分的的。为了证实扫描电镜下观察到的血小板的结构,透射电镜观察发现血小板能够被招募到动脉斑块上或粘附于内皮细胞上；同时能够清晰的观察到血小板的典型结构—微粒。再者,在ApoE-/-+HCD组小鼠的动脉粥样硬化病变处,扫描电镜观察到富含血小板,并包含大量红细胞和纤维素的血栓。5.HE.Masson和免疫组化染色检查5.1、GP Ⅱb/Ⅲa免疫组化染色结果：四组小鼠中,ApoE-/-+HCD组小鼠腹主动脉内皮表面上GP Ⅱb/Ⅲa的表达最多,其后依次是ApoE-/-+chow组,C57BL/6+HCD组,C57BL/6+chow组小鼠(p<0.05)；各组小鼠腹主动脉斑块内GP Ⅱb/Ⅲa的表达情况类似于内皮表面上GP Ⅱb/Ⅲa的表达。有趣的是,内皮表面上GP Ⅱb/Ⅲa的表达与斑块内GP Ⅱb/Ⅲa的表达具有显著的相关性(r=0.897,p<0.001)。其中,在ApoE-/-+HCD组小鼠的动脉粥样硬化病变处有富含GPⅡb/Ⅲa的血栓形成。5.2.HE、Masson染色和CD68、α-SMA的免疫组化结果：四组小鼠中,ApoE-/- +HCD组小鼠腹主动脉斑块中,表达阳性的巨噬细胞占整个斑块面积的百分比、斑块的核/帽比值(NC/FC)以及斑块的易损指数最高,其后依次是ApoE-/-+chow组,C57BL/6+HCD组,C57BL/6+chow组小鼠(p<0.05)；而各组小鼠平滑肌细胞占整个斑块面积的百分比的变化趋势正好相反。值得注意的是,斑块内皮表面上GP Ⅱb/Ⅲa的表达与斑块的易损指数和NC/FC均具有显著的相关性(r=0.922和r=0.903,各p<0.001)；整个斑块中GP Ⅱb/Ⅲa的表达与斑块的易损指数和NC/FC也均具有显著的相关性(r=0.858和r=0.857,各p<0.001)。6、细胞/血小板免疫荧光检测结果为了验证验证刺激对内皮的作用,采用不同浓度的TNF-α刺激HUVEC,免疫荧光检测HUVEC上vWF的表达,结果显示：TNF-α诱导HUVEC上vWF的表达是浓度依赖性的；而vWF诱导血小板上GPⅡb/Ⅲa的表达亦是浓度依赖性的。HUVEC或血小板只孵育二抗后不显示荧光,证明免疫荧光是特异性的。这进一步说明炎症刺激可诱导内皮细胞上vWF的活化进而启动血小板的活化或聚集,导致GP Ⅱb/Ⅲa在活化和粘附的血小板上的高度表达。因此,GP Ⅱb/Ⅲa可以作为易损斑块的生物标志的主要是由于炎症和vWF的活化,是和前期研究相一致的。7、动脉斑块的靶向成像分别随机经尾静脉弹丸式注射MB-cRGD和MB-CON 10 min后,在实验组中,MB-cRGD的CEU图像显示ApoE-/- +HCD组可见较明显腹主动脉超声显影,其后依次是ApoE-/- +chow组,C57BL/6+HCD组,C57BL/6+chow组小鼠；MB-CON在各动物组均无明显腹主动脉的超声显影增强。在封闭组中,MB-cRGD和MB-CON的CEU图像在各动物分组均未见明显腹主动脉的超声显影增强。对VI值进行定量分析：实验组和封闭组中,C57BL/6+chow小鼠组应用MB-cRGD和MB-CON的VI值各组之间均无显著性差异(p>0.05)；但在实验组中,其它3组动物应用MB-cRGD的VI值均显著高于应用MB-CON的动物分组(p<0.05)；MB-cRGD在ApoE-/-+HCD组小鼠ⅥI值是20.30±3.10,显著高于ApoE-/-+chow组(13.47±2.50,p<0.05)和C57BL/6+HCD组(6.99±1.68,p<0.05)。封闭组中,MB-cRGD在各动物分组的ⅥI值与MB-CON应用组比较均无显著性差异(p>0.05),均显著低于实验组的ApoE-/-+HCD组(p<0.05)和ApoE-/-+chow组(p<0.05),这进一步证明了MB-cRGD和GP Ⅱb/Ⅲa受体之间的结合是特异性的,而且可以被依替巴肽显著抑制。8、超声分子成像的Ⅵ值与组织病理学指标之间的相关分析Spearman相关分析结果发现,实验组中MB-cRGD的Ⅵ值与斑块内皮表面上和整个斑块中的GP Ⅱb/Ⅲa的表达均具有显著的相关性(r=0.877和1=0.872,各p<0.001)：而且,MB-cRGD的ⅥI值与斑块的易损指数和NC/FC亦均具有显著的相关性(1=0.883和1=0.875,各p<0.001)。结论1、动脉斑块内皮活化血小板表面的GP Ⅱb/Ⅲa受体与斑块的易损性显著相关,其可作为易损斑块的生物标志：2.GP Ⅱb/Ⅲa可通过“炎症刺激—内皮细胞vWF的活化—血小板活化或聚集”这一机制,在活化血小板上的高度表达,进而导致动脉粥样硬化斑块的不稳定。3、携MB-cRGD的超声分子成像可以定量评价动脉斑块内皮上血小板表面的GP Ⅱb/Ⅲa受体,其声强度与GP Ⅱb/Ⅲa表达水平和斑块易损性均显著相关,进而识别易损斑块,可以预防急性心血管事件的发生。