CXCR3(又称CD183)主要表达于记忆及活化T细胞、NK细胞及巨噬细胞表面,属G蛋白偶联受体超家族成员,具有七次跨膜结构。CXCR3基因定位于X染色体长臂13区(Xq13),由Loetscher等人于1996年首次从人来源的CD4+T细胞cDNA文库中克隆得到。其开放阅读框(openreading frame,ORF)长度为1107bp,编码一个由368个氨基酸组成,分子量大小为40.659KD的蛋白质分子。因基因剪接方式的不同,在人体中目前已发现存在3种CXCR3剪接变体,分别命名为CXCR3-A(通常指CXCR3)、CXCR3-B,以及CXCR3-alt;通过与其对应的三种配基(CXCL9/Mig、CXCL10/IP-10、CXCL11/I-TAC)结合介导自身生物学效应。小鼠与人CXCR3基因长度一致,同源性高达84%,可与人相关配基互相识别。研究发现,CXCR3通过受体-配体结合的方式介导信号转导,在诱导白细胞定向迁移的同时,与自身免疫性疾病、移植排异等疾病的发生、发展和预后密切相关。近些年研究证实CXCR3分子在一些恶性肿瘤如肝癌、乳腺癌、黑色素瘤细胞表面与组织中上也存在高表达,并显示出与肿瘤增殖及转移的高度相关性。本课题旨在采用本科室已自行构建成功能稳定分泌抗人CXCR3单克隆抗体(CXCR3mAb)的杂交瘤细胞株,经诱生腹水法及免疫亲和层析大量生产并纯化相应抗体。在此基础之上,选取多株表达CXCR3分子的人、鼠肿瘤细胞株,检测该单克隆抗体对不同细胞膜型分子的识别能力。同时采用MTT及TranswellTM实验研究CXCR3mAb对体外培养肿瘤细胞的增殖及迁移影响,继而选择高表达CXCR3分子、生长迅速且本身产生黑色素具有裸眼观察优势的鼠黑色素瘤细胞株B16建立小鼠黑色素肿瘤模型,进一步探究该抗体对肿瘤细胞体内致瘤性影响的相关分子机制。第一部分CXCR3单克隆抗体的制备及鉴定目的:制备CXCR3单克隆抗体并鉴定其生物学特性。方法:大量体外培养本科室已自行构建成功能稳定分泌抗人CXCR3mAb的杂交瘤细胞株9F5,选用裸鼠经体内诱生腹水法制备单克隆抗体;免疫亲和层析法纯化抗体;快速试纸法鉴定抗体亚型;流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析抗体效价。结果:经体内诱生腹水法成功制备CXCR3mAb,小鼠腹水形成率为100%,腹水收获量平均为5mL/只;经ProteinA柱亲和层析纯化后,腹水中抗体蛋白得率为2.5mg/mL;经小鼠IgG亚类快速定性试纸鉴定,抗体属IgG1亚型,轻链为κ链;FCM分析该抗体效价在0.5μg/1×106cell以上。结论:本实验成功制备出CXCR3mAb,为进一步的研究奠定了基础。第二部分CXCR3单克隆抗体对不同人、鼠肿瘤细胞株膜型分子的识别及对肿瘤细胞体外增殖迁移的影响目的:研究CXCR3mAb对不同人、鼠肿瘤细胞膜型CXCR3分子的特异性识别能力及体外介导的生物学效应。方法:分别选取人黑色素瘤细胞株A375、鼠黑色素瘤细胞株B16、人肝癌细胞株HepG-2及人乳腺癌细胞株MCF-7,并同时以表达膜型分子的抗人CXCR3基因转染细胞株L929-huCXCR3作为阳性对照,经FCM分析CXCR3mAb对上述细胞膜型分子的识别;选择高表达CXCR3、增殖快且自身合成黑色素具有裸眼观察优势的鼠黑色素瘤细胞株B16,MTT法分析体外培养条件下,CXCR3mAb分别在5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL 和 80μg/mL 浓度时对于 B16 细胞的增殖影响,并通过联合加入CXCR3高亲和力配体I-TAC,检测该抗体于体外同I-TAC对于细胞增殖的联合作用。根据MTT实验结果,在TranswellTM体系中分别往上室加入40g/mL抗体和同型IgG,24h后对迁至下室的B16细胞进行计数分析,探究该抗体对于体外培养细胞的迁移影响,并通过下室联合加入20ng/mL的I-TAC进行共培养,探究CXCR3mAb同I-TAC对于细胞迁移的联合作用机制。结果:FCM结果显示,CXCR3mAb与上述细胞结合的阳性率分别为98.2%、91.8%、74.7%、81.9%和99.2%;不同浓度的CXCR3mAb对B16细胞的增殖产生不同程度的抑制作用;当抗体浓度为40μg/mL时,CXCR3mAb对B16细胞的增殖抑制率达到16.4%,相比对照组,差异有统计学意义(P<0.001);20ng/mL的I-TAC即明显促进B16细胞的体外增殖,同时联合加入40μg/mL CXCR3mAb后,其增殖能力显著降低,结果相较于I-TAC组,抑制率达到24.3%(P<0.01);在TranswellTM迁移实验中,当上室单独加入40μg/mL抗体时,24h迁至下室细胞个数为23.40±3.05,同型IgG组迁移个数为68.00±5.39,迁移抑制率达到65.6%;当下室加入20ng/mL I-TAC进行共培养,抗体组与IgG组迁移数分别为38.00±6.20和97.80±6.34,迁移抑制率为61.1%。结论:本室制备的CXCR3mAb能够特异性的识别不同肿瘤细胞膜型分子CXCR3;该抗体加入肿瘤细胞培养体系后,可特异性封闭肿瘤细胞膜型CXCR3分子抑制其相关功能,继而降低肿瘤细胞体外增殖及迁移能力;根据与I-TAC联合作用结果显示,该抑制效应可能通过与I-TAC竞争性结合CXCR3分子上某一或数个共同的作用位点,阻断CXCR3-I-TAC信号通路而产生。第三部分CXCR3单克隆抗体对高表达CXCR3 B16细胞致瘤性的影响目的:构建小鼠黑色素瘤模型,对其进行抗体干预,并利用统计学、组织形态学、影像学等方法对抗体干预效果进行评估。方法:将60只6-8周龄BALB/c-nude裸鼠随机平均分成6组:A:皮下干预组;B:皮下IgG对照组;C:尾静脉干预组;D:尾静脉IgG对照组;E:皮下阴性对照组;F:尾静脉阴性对照组。A、B组腋下皮下接种B16细胞5×105cell/100μL/只;C、D组尾静脉接种B16细胞5×105cell/100μL/只,E、F组分别在腋下皮下和尾静脉注射等量生理盐水;A、C组分别在1、3、5、7天以10mg/kg剂量注射CXCR3单克隆抗体进行干预,B、D组注射等量同型IgG作为阳性对照;E、F组给与等量生理盐水。A、B组每天观察原位肿瘤的生长情况并测量记录肿瘤的长短径,以长径达到5mm时作为时间节点以评价不同组别小鼠的肿瘤出现时间,同时绘制肿瘤生长曲线;C、D组每天观察小鼠生存状态,10天时通过核磁共振技术观察小鼠黑色素瘤体内转移情况;第15天处死全部小鼠,大体解剖观察黑色素瘤体内转移情况;为探究转移机理,取静息状态下健康BALB/c-nude裸鼠分别制备肺、脑、肝及肾的组织匀浆,ELISA分别检测其组织中I-TAC表达量。结果:A、B组小鼠均在第4天形成肿瘤,成瘤率为100%,根据GraphPad Prism6绘制肿瘤生长曲线分析,至15天时,B组肿瘤平均体积达到3655.76mm3,A组相较B组肿瘤平均体积显著减小,仅为2057.30mm3(P<0.05);小鼠核磁共振成像观察显示,黑色素瘤在体内集中转移至肺部,D组相比于C组小鼠肺部转移结节数量明显增多,且多由肿瘤浸润而境界不清;小鼠大体解剖显示D组小鼠肺部转移瘤恶性程度明显高于C组,其结果与核磁共振结论相一致,且观察期内通过大体解剖和影像学两种方法皆未发现黑色素瘤转移至除肺以外的其它器官;ELISA结果显示,静息状态下的BALB/c-nude裸鼠肺部I-TAC表达量最高,达到22.61±0.34ng/g;脑部次之,为19.29±0.15ng/g;而在肝和肾上则表达较低,分别为 11.30 ± 0.41ng/g 和 15.41 士 0.27ng/g。结论:所有实验组小鼠均形成实体瘤,成瘤率达到100%,但相较于IgG对照组,干预组小鼠肿瘤的增殖及转移能力明显减弱,显示该抗体对于高表达CXCR3肿瘤细胞的体内恶性增殖及迁移具有一定的抑制作用。核磁共振结果显示B16黑色素瘤在小鼠体内集中转移至肺部,究其原因我们研究了小鼠主要器官中CXCR3高亲和力配基I-TAC的表达水平。实验证实小鼠静息状态下肺部I-TAC的表达水平明显高于其他器官,提示I-TAC的高表达是肺部易发生黑色素瘤转移的潜在重要影响因素之一。本科室自行制备的CXCR3mAb可封闭肿瘤细胞膜型CXCR3分子抑制I-TAC对肿瘤细胞的促增殖及趋化作用,进而抑制肿瘤细胞在体内的成瘤性,具有一定的抗肿瘤作用。