脱落酸(abscisic acid, ABA)是一种重要的植物激素,在植物生长、发育以及对环境的适应中起着重要的信号分子作用。细胞溶质游离Ca2+([Ca2+]i)是植物细胞信号转导中最基本的第二信使,它几乎介导植物生长发育的所有过程以及众多的胁迫反应。CaM是真核生物中一种研究得最清楚的Ca2+受体,大量研究显示CaM(calmodulin)参与植物生长发育的调控以及植物对各种环境刺激的反应在胁迫反应及激素反应中,Ca2+/CaM和H2O2之间存在交叉反馈机制。研究显示,Ca2+/CaM参与ABA诱导的玉米叶片抗氧化防护过程,且作用于H2O2的上游与下游。CCaMK(calcium and calmodulin regulated kinase)有可能是下游信号分子,作为桥梁将ABA和H2O2信号继续传递,诱导了抗氧化防护系统。本章首先用半定量和定量RT-PCR的方法确定了水稻中的钙/钙调素依赖蛋白激酶OsDMI3(Oryza Sativa does not make infection3)被H2O2(10mM)、 ABA (100μM)和PEG(10%模拟自然界水分胁迫)诱导表达,并且活性也有被激活。用5mM LaCl3、5mM EGTA、300μM W-5、300μM W-7、10μM KN-92和10μM KN-93鉴定出OsDMI3具有钙-钙调素蛋白激酶的性质。结合本实验室之前的研究,H2O2、ABA和PEG依次诱导OsDMI3基因表达,推测信号转导的方向是从PEG到ABA再到H202。之后的抑制剂实验印证了我们的推测：ABA合成抑制剂fluridone干扰了PEG对OsDMI3的诱导,H2O2清除剂DMTU和NADPH氧化酶抑制剂DPI也影响到ABA对OsDMI3的诱导。从ABA诱导H2O2积累和激活OsDMI3时间进程上来看H2O2积累先于OsDMI3的激活,实验用DAB对组织中H2O2染色也显示OsDMI3不影响H2O2的原初产生,但对H2O2后来的积累有明显贡献。这种交叉反馈类似于玉米中H202与MAPK的交叉反馈,MAPK与OsDMI3的相互作用可能是这两个交叉反馈的共同机制。我们用抑制剂实验,初步确定了OsDMI3可以影响ABA诱导的抗氧化防护酶SOD与CAT。100μM ABA可以诱导抗氧化防护酶SOD与CAT活性上升。OsDMI3的突变体NF8513与野生型相比,在ABA诱导下,突变体的抗氧化防护酶SOD与CAT活性峰被抑制。进一步测定野生型和NF8513株系在15%PEG和100mM H2O2处理下MDA含量变化和电解质泄露的变化,发现在两种胁迫下突变体的指标显著高于野生型。为了进一步研究这种差别,突变体和野生型被进一步用于表型实验,结果水分胁迫下的突变体显示了较弱的耐受性。在做这些验证实验的同时我们克隆了OsDMI3基因,构建了OsDMI3基因的干扰载体,并通过农杆菌侵染的方法转化水稻幼胚,检测获得了转基因水稻株系I3。转基因植株的抗氧化防护系统存在缺陷,并表现出对水分胁迫更加敏感。促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)是真核细胞中普遍存在的信号组分,由逆境胁迫、细胞因子、植物激素、生长因子等诱导,并在植物信号中发挥重要的作用。我们试图阐释OsMPK1和OsDMI3的上下游关系。首先进行的原生质体RNAi实验显示：干扰OsDMI3可以抑制OsMPK1基因表达和OsMPK1活性的诱导；对OsMPK1基因进行干扰,OsDMI3基因表达和OsDMI3酶活性没有显著变化。另外外源处理钙离子也可以诱导OsMPK1基因表达和OsMPK1活性上调,OsDMI3是这个过程的必要条件,在信号通路中OsMPK1的上游。OsDMI3跟OsMPK1的纯和突变体NF8513和NE1901实验验证了上述基因的关系。