NHE家族是存在于所有真核细胞细胞膜上的一种离子交换蛋白,介导细胞外的钠离子和细胞内的氢离子以1:1交换,其中NHE1亚型分布最为广泛。NHE1蛋白在调节细胞内pH值(pHi)、稳定细胞容量、参与离子转运、启动细胞增殖分化和凋亡、调节肿瘤细胞行为如侵袭和转移等方面具有重要的作用。最新提出的以调节肿瘤细胞内pH值为目标的基因治疗中,NHE1受到格外重视。研究表明NHE1基因在许多肿瘤细胞,如肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌等细胞中有高表达,且其mRNA转录拷贝数比正常细胞增高约10倍,保证了Na+/H+泵数量与活性的升高。癌细胞具有无氧糖酵解优势,细胞内代谢产生大量的乳酸和H+,但癌细胞内pH值偏碱性(pHi=7.12-7.65),组织间液的pH值(pHe)多为6.2-6.9。因此,在肿瘤细胞内外产生与正常细胞相反的pH值梯度,并且这种梯度随着肿瘤的发展而进一步扩大。癌细胞pH值内高外低的形成和维持主要是由于细胞膜NHE1的激活和mRNA表达增加,从而使肿瘤细胞进行有效的Na+/H+交换,将大部分H+泵出细胞外,形成肿瘤细胞组织的酸性环境,保持细胞内pH值为中性或碱性,从而使肿瘤细胞免受凋亡。本文就着眼于此,探索NHE1基因在人肝细胞肝癌中表达,以及在细胞转移和侵袭中的意义,并且通过构建pIRES2-AcGFP1-NHE1质粒,为进一步研究NHE1在肝癌中的调控机制打下基础,期待为肝癌基因治疗提供新靶点。第一部分目的:探索人肝癌、癌旁组织中钠氢交换蛋白NHE1 mRNA的表达变化及意义。方法:连续收集自2007年12月到2008年04月,我科手术病理证实的、未行栓塞化疗的34例肝细胞肝癌患者标本,同时收集正常肝组织。取新鲜肝癌中最典型的癌灶部分、癌旁组织以及对照肝组织,将所有组织进行RT-PCR检测。结果:所有肝癌组织和癌旁组织均表达NHE1,相对表达量分别为2.892±0.882和0.802±0.206;作为对照的21例正常肝组织NHE1的相对表达量为0.872±0.186。肝癌组织和癌旁组织的NHE1 mRNA相比,两者存在显著性差异(t=13.458,P<0.001);肝癌组织和对照正常肝组织的NHE1 mRNA相比,两者亦存在显著性差异(t=10.320,P<0.001);癌旁组织和对照正常肝组织NHE1 mRNA相比,两者差异无统计学意义(t=1.276,P>0.10)。将同一患者的肝癌组织和癌旁组织的NHE1 mRNA相比,两者存在显著性差异(t=13.168,P<0.001)。结论:NHE1 mRNA在肝癌组织的表达增高,可能在肝癌的发生机制中起一定的作用。第二部分目的:肝癌组织中NHE1蛋白的表达以及与肝癌侵袭转移的关系。方法:连续收集自2007年12月到2008年04月,我科手术病理证实的、未行栓塞化疗的34例肝细胞肝癌患者标本,同时收集正常肝组织。取新鲜肝癌中最典型的癌灶部分、癌旁组织以及对照肝组织,将所有组织进行免疫组化染色,检测NHE1蛋白的表达水平,分析人HCC组织中NHE1蛋白的表达情况与临床病理因素之间的相关性。结果:人HCC组织中NHE1蛋白的表达显著高于癌旁组织中NHE1蛋白的表达(t=17.821,P<0.05),其阳性率也显著高于癌旁组织(χ2=42.507,P<0.05)。NHE1蛋白的表达与组织学分级、临床TNM分期以及有无门静脉癌栓密切相关(P<0.05),而与HCC患者的年龄、肿瘤大小、肿瘤个数、血清AFP水平临床病理学指标无关(P>0.05)。结论:NHE1蛋白在人HCC组织中表达水平升高,可能与HCC的恶性程度、疾病的进程以及人HCC的侵袭转移有密切的关系。第三部分目的:构建钠氢交换蛋白1(NHE1)真核表达质粒。方法:利用RT-PCR方法扩增带有Xhol I和sal I酶切位点的NHE1编码基因,插入T载体测序正确后,克隆入pIRES2-AcGFP1真核表达载体,然后进行酶切和测序鉴定。结果:成功克隆了人NHE1基因,并进行了DNA序列分析和基因库报道的基因序列基本一致,然后将克隆的NHE1基因插入克隆载体pIRES2-AcGFP1,成功构建了重组表达质粒pIRES2-AcGFP1-NHE1,并分别进行了菌落分析和酶切鉴定。酶切及测序结果证明pIRES2-AcGFP1-NHE1表达质粒的DNA序列完全正确。结论:成功构建pIRES2-AcGFP1-NHE1真核表达质粒,真核细胞中GFP的表达可作为NHE1表达的标志,为进一步研究NHE1在肝癌中的调控机制打下基础。