第一部分槲皮素对慢性髓性白血病细胞增殖、凋亡影响及其机制研究慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是克隆性的髓系造血干细胞增殖性疾病,占成人白血病的15%。CML患者以9号染色体和22号染色体平衡易位形成t(9;22)染色体,即费城染色体(Philadelphia,Ph)为特征。甲磺酸伊马替尼是首个被批准用于一线治疗CML的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKIs),可以与BCR-ABL的ATP结合位点靶向结合,阻断BCRABL的磷酸化作用,抑制其酪氨酸激酶活性,从而抑制细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。自问世以来,显著地改善了CML患者的预后。然而,在接受伊马替尼治疗的CML-CP患者中,约有15%-25%的患者因对伊马替尼耐药或不耐受而导致治疗失败,且进展期的患者中伊马替尼耐药比例更高。根据ELN2013版指南推荐,伊马替尼治疗失败的患者可以换用二代TKIs或考虑异基因干细胞移植。然而,二代TKIs药物及异基因干细胞移植费用均非常昂贵,许多患者难以承受。因此,易获得且毒副作用低下的新治疗药物具有重要的临床意义。槲皮素(1,3,4,5,7-五羟基黄酮,Ouercetin)是类黄酮化合物的一种,广泛分布于自然界的各类植物中。有研究认为,槲皮素对黑素瘤、肺癌等表现出抗肿瘤的活性,其作用与多个信号通路相关。我们的前期研究已经证实槲皮素联合低浓度伊马替尼可以诱导K562细胞凋亡。本研究中,我们选用伊马替尼敏感及耐药的人红白血病细胞株K562、K562R、K562G,利用细胞计数检测槲皮素单药对伊马替尼敏感及耐药细胞株增殖抑制作用;利用Annexin V-PI双染实验通过流式细胞术检测槲皮素单药对伊马替尼敏感及耐药细胞株的诱导凋亡作用;利用流式细胞术检测槲皮素作用后细胞周期分布;利用瑞氏染色检测槲皮素单药对作用后不同时间点的细胞形态变化;利用蛋白印迹(Western blot)检测相关通路蛋白变化。结果显示,槲皮素单药对伊马替尼敏感及耐药细胞株具有时间依赖性的增殖抑制作用;槲皮素单药可以显著抑制伊马替尼敏感及耐药细胞增殖;Annexin V-PI双重染色结果提示,槲皮素处理伊马替尼敏感及耐药细胞48小时后,凋亡细胞百分比较对照组显著增加,提示槲皮素可以诱导伊马替尼耐药细胞株的凋亡。同时,蛋白免疫印迹结果显示,槲皮素可以诱导caspase-3剪切,且并不诱导BCR-ABL的表达水平及激酶活性改变。为了进一步探究槲皮素诱导凋亡的机制,我们检测了槲皮素作用48小时后细胞的周期分布,结果显示,三株细胞G2/M期细胞百分比均明显升高,,另外,蛋白免疫印迹检测γ-H2AX、JNK,发现两者表达水平均升高,证明槲皮素诱导细胞周期阻滞的作用与DNA双链损伤及JNK通路活化相关。结论:槲皮素对慢性髓性白血病耐药细胞株具有增殖抑制和诱导凋亡作用,且不依赖于BCR-ABL的表达改变。槲皮素通过诱导细胞周期阻滞引起细胞凋亡,此作用可能与JNK通路活化、DNA双链损伤相关。第二部分Xnd-4对急性早幼粒细胞白血病耐药细胞株的诱导分化作用及机制研究急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)是一种侵袭性较强的白血病,约占急性髓性白血病(Acute myeloid leukemia,AML)的10%。APL的细胞遗传学特征为t(15;17)染色体易位,使得15q22的PML基因与17q21的RARα基因融合产生PML-RARα基因,从而编码PML-RARα融合癌蛋白。形成PML-RARα蛋白后,PML及RARα的功能被显性负干扰,PML的促分化、凋亡、抑制增殖的功能受抑制,RARα的信号转导过程被干扰,从而使粒系分化受阻,早幼粒细胞大量堆积,促使APL的发生。药理浓度(0.1～1μM)的ATRA可以通过蛋白酶体途径、自噬途径等诱导PML-RARα融合蛋白的降解,恢复PML的核定位,解除RARα的转录抑制,诱导早幼粒细胞分化,从而达到治疗APL的目的。目前,以全反式维甲酸(ATRA)为基础,联合蒽环类药物、亚砷酸或阿糖胞苷类药物的诱导疗法可以使患者的初治完全缓解(CR)率达到80%～90%。然而,ATRA的耐药问题也日益突出。据文献报道,约20～30%的原发性APL患者会产生ATRA耐药,在CR后3～6个月复发,复发后疗效较差,再次CR后三年生存率仅为50%左右。因此,寻找新的治疗药物,以克服APL患者对ATRA耐药具有重要的临床意义。黑种草(Nigella glandulifera Freyn)是毛莨科(Ranunculacease)黑种草属(Nigella)植物,是我国新疆维吾尔族的传统药材。近年来,有研究者运用现代医学的方法对黑种草的药理作用进行研究,发现黑种草提取物具有降血糖、降血脂、抗炎、抗哮喘、抗氧化等一系列生物活性。同时,有文献报道,黑种草提取物在体内外对黑素瘤、肾癌、埃里希腹水等具有抗肿瘤作用。Xnd-4是从黑种草果中提取的小分子化合物。通过药物筛选,我们发现Xnd-4在较低剂量(1.25～10μmol/L)时对NB4及两个耐药细胞株NB4LR1、NB4LR2表现出时间及剂量依赖的增殖抑制作用。选择合适浓度Xnd-4分别处理NB4、NB4LR1、NB4LR2细胞72h、120h后,流式细胞术检测发现三株细胞表面CD11b表达增加,瑞氏染色观察细胞的形态学改变可见,三株细胞均出现细胞核分叶、核浆比变小,提示细胞向粒-单核细胞分化的可能。同时,蛋白免疫印迹实验结果显示细胞内C/EBPβ的表达呈时间依赖性上升,进一步证明细胞发生了分化。接下来我们探索了Xnd-4可能的作用机制。PML-RARα是绝大部分患者发生APL的始动因素,全反式维甲酸和三氧化二砷是临床上常用的靶向PML-RARα的药物,可以直接结合并诱导PML-RARα降解。我们通过蛋白免疫印迹实验发现,Xnd-4并未造成PML-RARα的表达减少。接下来我们探索了可能的作用机制。C-Myc是原癌基因Myc家族成员,在约70%的肿瘤中存在着过表达或突变,是最常见的高度扩增的癌基因之一,在细胞分化的过程中发挥着重要的作用,与肿瘤细胞耐药性也有密切的关联。蛋白免疫印迹实验结果显示,Xnd-4分别作用于NB4、NB4LR1、NB4LR2细胞72h、120h后,C-Myc表达水平呈时间依赖性下降。接下来我们在三个细胞株中过表达了C-Myc,流式细胞术检测细胞表面CD11b的表达,发现过表达CMyc的细胞对Xnd-4的敏感性下降。我们收集了三例APL患者标本,用Xnd-4处理72h、120h后检测细胞的形态、细胞表面CD11b的表达水平及C-Myc的表达,得到与细胞株相一致的结果。结论:Xnd-4通过降低C-Myc的表达水平,诱导NB4、NB4LR1、NB4LR2的分化,而C-Myc的过表达诱导细胞对Xnd-4的耐药。