金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌,经常污染食品,给人类健康带来很大的危害。合成防腐剂已经在食品中应用了很多年,然而一些防腐剂对人类健康的影响时常会受到质疑。近年来,随着消费者对天然食品产品的需求的增加,天然抑菌剂——尤其是植物源抑菌化合物,得到了越来越多的关注。探索安全、有效的抗菌物质对于预防和控制金黄色葡萄球菌等微生物类污染具有十分重要的意义。石榴是一种药食两用的植物资源,不仅含有丰富的营养,而且具有多种医疗保健功效。石榴皮为石榴加工产业的副产物,因其富含多酚类物质,在食品、医药等领域显示出了极大的应用价值。安石榴苷是石榴皮中的主要成分之一,研究表明,安石榴苷具有抗氧化、抗癌、抗炎症、抗病毒等生物活性,并且对多种食源性致病菌具有抑制作用。本研究的主要目的是从石榴皮中分离纯化得到安石榴苷,确证安石榴苷对金黄色葡萄球菌的抑制效果,从菌体超微结构、毒力因子表达、生物膜形成和蛋白质组的角度阐明安石榴苷的作用机理,为安石榴苷的开发利用奠定理论基础。主要研究成果如下:(1)采用Amberlite XAD-16大孔吸附树脂对石榴皮提取物进行纯化,以甲醇为洗脱剂进行梯度洗脱,可以获得较高纯度的安石榴苷;随着洗脱剂浓度的升高,安石榴苷的含量呈现先升高后降低的趋势,最高质量分数达79.6%;安石榴苷纯化物对金黄色葡萄球菌表现出良好的抑菌效果,并且纯化物浓度越高,产生的抑菌圈直径越大。(2)安石榴苷对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.25 mg/mL;在致死浓度下,经安石榴苷作用后,金黄色葡萄球菌的细胞膜电位降低,即发生超极化现象;安石榴苷促使金黄色葡萄球菌胞内钾离子释放到胞外;通过扫描电子显微镜观察到,安石榴苷结合到菌体表面,形成一层聚合物,使菌体表面变得粗糙,且安石榴苷浓度越高,聚合物越厚,从而使菌体细胞受损,导致菌体死亡;透射电子显微镜图像显示,安石榴苷处理后菌体体积变大,同样可见菌体外包裹的聚合物。(3)在亚抑菌浓度下,安石榴苷能够降低α-溶血素、血浆凝固酶和总肠毒素的表达;经1/8×MIC浓度的安石榴苷处理后,肠毒素基因sea、溶血素基因hla和调节基因agrA的转录水平显著降低。(4)在不显著抑制金黄色葡萄球菌生长的浓度下,安石榴苷能够显著抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成。通过结晶紫染色法、MTT法和菌落计数法研究发现,随着安石榴苷浓度的增加,对生物膜的抑制作用增强,生物膜内的细菌数量降低;扫描电子显微镜和激光共聚焦显微镜结果直观地说明了安石榴苷抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成,并且在扫描电镜下可以看到经安石榴苷处理的细菌表面形态发生明显变化;在1/32和1/16×MIC浓度下,安石榴苷抑制fib、ebps基因的表达,增强icaA、cidA基因的表达,对agrA、fnbA、clfA、clfB、sarA、eno和sigB基因的表达无显著影响。(5)采用串联质谱标记与高效液相色谱及质谱联用技术共检测出了1026种蛋白,其中安石榴苷处理组与对照组之间存在423种蛋白的表达量有显著差异(P<0.05)。在表达量有显著差异的蛋白中,有251种蛋白表达下调,172种蛋白表达上调;显著差异表达的蛋白最主要是细胞质蛋白(77%),其次是细胞质膜蛋白(7%),细胞壁和胞外蛋白分别占了2%;安石榴苷处理后,对金黄色葡萄球菌许多代谢通路都产生了影响,尤其是嘌呤代谢、嘧啶代谢和三羧酸循环通路,其中许多关键酶的表达受到了抑制,因而对这些信号通路起到了抑制作用,进而抑制了细菌的生长和增殖。