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目的:分析HBV(Hepatitis B virus,HBV)HBsAg+抗HBs双阳性患者S基因主要亲水区(major hydrophilic region,MHR)新增N-糖基化突变特点,揭示HBsAg+抗HBs双阳性的发生机制和临床意义。方法:对284例HBsAg+抗HBs双阳性和314例HBsAg单阳性乙型肝炎病毒感染者S基因扩增及测序分析。对1例携有MHR区双N-糖基化新型突变株的慢性乙肝患者血清样本进行随访收集和深入研究,对HBV前S/S基因进行扩增和克隆测序,观察新增双N-糖基化突变的演变过程。构建pcDNA3.1(-)-myc-His A和pTriEx-mod-1.1HBV野生株、2种临床变异株和定点回复突变株重组质粒,瞬时转染HepG2肝癌细胞,采用实时荧光定量PCR法检测细胞培养上清中HBV DNA和细胞内复制中间体水平,分析突变对病毒复制力和分泌能力的影响,并对细胞培养上清中HBs Ag进行绝对定量,同时采用Western blotting和免疫荧光技术对HBsAg-His融合蛋白进行检测,分析突变对病毒抗原性的影响。结果:284例HBsAg+抗HBs双阳性患者中MHR区新增N-糖基化突变的检出率为11.3%(32/284),显著高于314例HBsAg单阳性患者的2.9%(9/314)(P<0.01)。284例HBsAg+抗HBs双阳性患者中72例为肝细胞癌(Hepatocellμlar carcinoma,HCC),在HBsAg+抗HBs双阳性伴新增N-糖基化突变者中检出率为46.9%(15/32),显著高于HBsAg+抗HBs双阳性未伴新增N-糖基化突变的22.6%(57/252)(P<0.01)。从1例患者中检出的新型株突变形式为s116-118TST→NST+s131-133TSM→NST,并联合sP120缺失+G145D突变,在3份随访样本中该突变株分别占98.0%、2.0%和2.5%,在第2份样本中检出s130-132GTS→NSS单N-糖基化突变株,占17.6%,但无sP120缺失+G145D联合突变。与野生株相比,新型突变株复制力提高31%,但HBsAg定量降低。免疫荧光结果显示,双N-糖基化定点回复突变株可部分恢复HBsAg检出水平,提示除双N-糖基化突变外,s P120缺失+G145D联合突变对HBsAg抗原性减弱也有明显影响。结论:HBV S基因MHR区新增N-糖基化突变与HBsAg+抗HBs双阳性相关,两者同时出现可能是HCC发生的高风险因素;S基因MHR区新增双N-糖基化+sP120缺失+sG145D联合突变共同影响HBsAg抗原性。