抗生素最开始是作为促生长添加剂使用，能显著促进动物生长，提高饲料报酬，并起到预防疾病的作用。但是伴随着抗生素在动物生产中的长期、不合理使用，越来越多的负面影响也日渐突出，如抗生素耐药性及畜产品中的残留问题等。因此，越来越多的研究开始关注抗生素替代品的开发。黄芪多糖（Astragalus Polysaccharides，APS）是中草药黄芪的重要组成成分，具有抗炎和免疫调节等生物学活性，且无残留、毒副作用小。本研究分4个试验，采用体外检测和体内验证相结合的方法，探讨APS的抗炎活性，并系统研究硫酸化修饰对APS抗炎活性的影响，以期为抗生素替代品的研发提供理论依据。试验一黄芪多糖的体外抗炎活性研究本试验采用脂多糖（LPS）刺激建立Caco2细胞体外炎症模型，研究添加方式和剂量对APS抗炎效果的影响。APS（0、25、50、100和200μg/mL）和1μg/mL LPS以下述三种方式添加：（1）治疗添加组，先用LPS刺激24h，再用APS孵育24h；（2）预防添加组，先用APS孵育24h，再用LPS刺激24h；（3）同时添加组，将LPS和APS混合后共同孵育细胞48h。用RT-qPCR方法测定炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-8）和紧密连接蛋白（ZO-1和occludin）的mRNA表达，用Western Blot方法检测紧密连接蛋白表达，用Ussing Chamber系统测定单层细胞短路电流（Isc）。结果显示，LPS刺激显著提高三种添加方式下Caco2细胞TNF-α、IL-1β和IL-8的mRNA表达和Isc值（P <0.05），添加100μg/mL APS可显著降低三种炎症因子的mRNA表达和单层细胞Isc值（P<0.05）APS在治疗、预防和同时添加时的最低有效抗炎浓度分别为100、50和100μg/mL。1μg/mL LPS刺激降低预防添加组occludin mRNA的表达（P <0.05），下调了3种添加方式下ZO-1和occludin蛋白的表达；100μg/mL APS孵育提高治疗添加组ZO-1和预防添加组occludin的mRNA和蛋白表达，提高预防添加组ZO-1的蛋白表达。研究结果表明，100μg/mLAPS孵育对LPS刺激Caco2细胞具有抗炎保护作用，且预防添加时效果更好。试验二黄芪多糖的硫酸化修饰及其细胞毒性分析功能性多糖的生物学活性与其结构有着密切的关系，本研究采用氯磺酸吡啶法对APS进行硫酸化修饰，分析硫酸化APS（SAPS）的结构特性及细胞毒性。SAPS中硫酸基的取代度（DS）根据Antonopoulos方法计算，即DS=(1.62×S%)/(32-1.02×S%)。采用AVATAR330红外光谱仪和溴化钾压片法在400-4,000cm-1范围内对SAPS进行扫描。SAPS的细胞毒性采用MTT方法测定，将1000、500、250、100、50、25和10μg/mL的SAPS添加到Caco2细胞培养基中培养24h，在570nm处测定吸光度，吸光度的大小与活细胞的数目呈正相关。结果显示，本试验中得到的SAPS的DS为1.4，红外光谱显示SAPS除了具有多糖特征性吸收峰外，在1265cm-1左右出现了一个新的吸收峰，为不对称S=O伸缩振动吸收峰，另一个新的吸收峰出现在810cm-1处，为C-O-SO3基团的对称C-O-S吸收峰，这两个特征性的吸收峰表明硫酸基已经与多糖结合成酯，即黄芪多糖硫酸酯。高浓度SAPS（250、500和1000）可显著降低Caco2细胞的OD570，具有一定的细胞毒性；但低浓度SAPS（10、25、50和100）对OD570无显著影响，不具细胞毒性，因此在后面的试验中选择25、50和100μg/mL作为SAPS添加浓度。试验三硫酸化黄芪多糖的体外抗炎活性研究本试验进一步比较SAPS和APS的体外抗炎活性。不同浓度SAPS (25、50和100μg/mL，简写为SAPS-25、SAPS-50和SAPS-100)，100μg/mLAPS（APS-100）和1μg/mLLPS按下述三种方式添加到培养基中：治疗添加组，先用LPS刺激24h，再用SAPS或APS孵育24h；预防添加组，先用SAPS或APS孵育24h，再用LPS刺激24h；同时添加组，将LPS和SAPS或APS混合后共同孵育细胞48h，以DMEM培养基作为空白对照，孵育48h，每个处理6个重复。用RT-qPCR方法检测炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-8），紧密连接蛋白（ZO-1和occludin）和Toll样受体4（TLR4）的mRNA表达量，用Western Blot方法检测紧密连接蛋白和TLR4的蛋白表达。LPS刺激提高三种添加方式下细胞炎症因子（TNF-α、IL-1β和IL-8）和TLR4的mRNA表达（P <0.05）；降低治疗添加组和同时添加组ZO-1和occludin的mRNA表达（P <0.05），降低预防添加组ZO-1和occludin的蛋白表达。与LPS刺激组相比，100μg/mL的APS和SAPS均降低三种添加方式下细胞三种炎症因子的表达（P <0.05），SAPS-25降低治疗添加组和预防添加组三种炎症因子的表达（P <0.05）；APS-100提高三种添加方式下occludin的mRNA和蛋白表达，SAPS-100提高预防添加组ZO-1和occludin的蛋白表达，而且低浓度SAPS（25和50μg/mL）提高预防添加组ZO-1和occludin的mRNA表达（P <0.05）；添加APS和SAPS均降低TLR4的mRNA和蛋白表达，且不受添加方式和剂量的影响。结果表明，SAPS通过降低炎症因子和TLR4表达、提高紧密连接蛋白表达发挥抗炎活性，达到相同的抗炎效果所需的SAPS剂量低于APS，且预防添加时效果更好。试验四黄芪多糖和硫酸化黄芪多糖对LSP刺激肉仔鸡的抗炎及免疫调节活性研究本试验通过LPS刺激建立肉仔鸡肠道炎症模型，进一步研究APS和SAPS的体内抗炎活性与免疫调节作用。180只肉仔鸡随机分为6个处理，16-18日龄连续3天分别左侧胸肌注射生理盐水，生理盐水，APS（4、8mg/kg·BW，简写为APS-4、APS-8）和SAPS（4、8mg/kg·BW，简写为SAPS-4、SAPS-8），19和20日龄第1组注射生理盐水作为空白对照，其余5组腹腔注射1mg/kg·BW LPS。记录生长性能和免疫器官指数，测定血液指标、淋巴细胞增殖、肠道形态，用RT-qPCR方法测定炎症因子（TNF-α、IL-1β和IFN-γ）、紧密连接蛋白（ZO-2和occludin）和TLR4的mRNA表达。结果显示，LPS刺激降低肉仔鸡日增重（BWG）、采食量（FI）、空肠绒毛高度和上皮内淋巴细胞数目（P<0.05）；提高料重比（FCR）、脾脏指数、血液中异嗜细胞：淋巴细胞（H:L）比率、血浆NO浓度和T淋巴细胞上清液NO、TNOS和iNOS浓度（P <0.05）；上调了空肠IL-1β和IFN-γ的mRNA表达，下调了空肠ZO-2和occludin的mRNA表达（P <0.05）。SAPS-8提高肉仔鸡BWG和空肠绒毛高度（P <0.05），APS-8降低肉仔鸡血浆NO浓度（P <0.05）；肌注APS和SAPS均降低肉仔鸡FCR、血液中H:L比率和淋巴细胞上清液中TNOS和iNOS的浓度，并提高空肠上皮内淋巴细胞数目（P <0.05）；SAPS-4和SAPS-8降低空肠TNF-α和IL-1β的表达（P <0.05），APS-8和SAPS-8提高肉仔鸡空肠ZO-2和occludin的表达，SAPS-4降低TLR4的表达（P <0.05）。本试验结果表明，APS和SAPS对LPS刺激肉仔鸡都具有生长促进作用，这主要是通过发挥抗炎活性和一定程度的免疫调节作用实现，且同等剂量SAPS的效果优于APS。本研究表明，APS能够通过降低炎症因子表达和提高紧密连接蛋白表达来抵抗LPS的感染；APS和SAPS都具有体外的抗炎活性和体内的免疫调节、促生长活性，且在预防添加时APS和SAPS的抗炎效果较好，表明APS和SAPS可作为肉仔鸡的抗炎或者免疫调节添加剂使用；同等剂量SAPS的抗炎和免疫调节效果优于APS，表明硫酸化修饰提高APS的抗炎和免疫调节活性。