目的冠心病和脑卒中等心血管疾病是一种发生率和病死率很高的疾病,是人类头号健康杀手。CPG为临床常用心血管疾病药物,其主要问题是约5-40%的患者对该药物反应较差,服药后复发性缺血事件的发生和由此引起的死亡率仍居高不下。为此,寻找疗效显著且安全性高治疗策略为各国研究者关注的重点。FDDP由丹参、三七、冰片三味中药构成,具有增加冠脉血流量,扩冠,抗血小板等药理作用,临床上常与氯吡格雷合用于心血管疾病,但具体机制不清楚。有关于中西药协同作用机制研究,目前主要侧重于药物代谢酶基因多态性、单成分药代(药效)方面,而对中西药联用后对中药活性组分(代谢物)的蛋白结合率、药代及药效协同作用机制尚未报道。本课题选择临床上心血管疾病应用广泛的中西药结合案例(FDDP+CPG),分别从蛋白结合率、药代动力学、药效学、虚拟药理学等方面考察中西药活性成分间协同作用特征。方法1.以FDDP活性组分人参皂苷Rg1、Rb1为指标分析物,分别采用平衡透析法和分子对接两种实验方法,分别考查CPG对胎牛血清中Rg1和人源血清中Rb1蛋白结合率协同影响,研究CPG-FDDP蛋白结合率协同作用;2.采用分子对接技术,模拟生理条件下考察FDDP活性组分与参与CPG代谢酶CES1、细胞色素CYP2C19、CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4蛋白间作用效应和作用模式、以及与相关氨基酸残基的结合情况,考察两种药物在氯吡格雷代谢酶层面的相互作用;3.选择以人参皂苷Rg1、CPGS为指标检测物,大鼠为对象,通过建立血浆中指标分析物含量测定方法,结合药代动力学性质,分别比较研究两种药物单独给药和合并给药组21天,单次给药和长期给药后各组间活性组分Rg1、代谢物CPGS药代动力学行为差异,考察FDDP-CPG药代学相互作用特征;4.首先选择动-静脉旁路血栓、凝血四项、P2Y12靶酶考查指标,研究短期用药(连续给药21天)两种药物协同作用;然后选择血液流变学(7个)、血凝参数(3个)、血细胞参数(22个)三种共计32个指标,观察长期(给药100天)FDDP与CPG协同效应,多角度考察两种药物的协同增效;5.在系统全面考察心血管靶酶病因病机基础上,选择了 27个心血管靶酶疾病相关的药物作用靶点,构建FDDP活性组分数据库,综合运用分子模拟方法考察FDDP与各靶酶间作用效应,最后采用网络药理学方法对活性组分-蛋白间结合效应进行可视化分析,考察FDDP基于心血管靶酶网络的药效物质基础。结果1.人参皂苷Rg1低、中、高三种浓度0.3125、1.2500、5.0000mg·L-1下与胎牛血清蛋白结合率分别为11.16±2.82、13.42±4.21、14.61±3.42,当合并加入2.0000 mg·L-1CPG 后蛋白结合率分别下降为 6.53±2.32、9.23±4.54、12.12±3.72;Rb1低(0.6250 mg·L-1)、中(1.2500 mg·L-1)、高(5.0000 mg·L-1)下与人血清蛋白结合率分别为 58.17±3.82、57.43±3.21、55.63±3.42,当合并加入 2.0000mg·L-1CPG后蛋白结合率分别下降为46.54±3.35、49.25±3.56、48.15±3.76;分子对接结果显示Rg1、Rb1分别于胎牛血清、人源血清存在一定的结合效应,与氯吡格雷存在协同作用。2.分别以 1MX1(CES1)、3NXU(CYP450 3A4)、4GQS(CYP450 2C19)、2HI4(CYP450 1A2)、3IBD(CYP450 2B6)为受体,THA、RIT、OXU、Chlorzoxazone、CPZ为阈值(cutoff),FDDP中分别有29、8、31、51、44个化合物分子与上述蛋白间存在一定的结合效应。3.(1)Rg1药代结果显示:和单独给药组相比较,Ke下降,T1/2α、AUC、Tmax、Cmax、MRT上升,其中T1/2α、AUC、MRT有统计学差异,此部分结果与第一章蛋白结合率结论相呼应,即合用CPG使得Rg1蛋白结合率下降,从而在体内驻留时间及血药浓度增加。(2)CPGS药代结果显示:与CPG单独给药组相比较,合并FDDP组T1/2α、TmaxMRT增加,Cmax、AUC下降,FDDP对指标物CPGS药代参数及药时曲线有一定影响;与第一周期CPG单独组相比较,第二周期单独组Tmax略有下降,Cmax、AUC(0-tn)、AUC(0-∞)均显著增加,表明多次长期给药后(21天),CPGS在机体内蓄积程度加重,使得该指标物无法正常排除体内以维持稳态的药时曲线;和第二周期单独给药组相比较,第二周期合并组T1/2α、Cmax、AUC(0-tn)、AUC(0-∞)显著下降,药时曲线几乎在单独给药组曲线以下,合并用药组中大鼠血浆CPGS降低。4.短期21天结果显示,与单独给药组相比较,合并给药组血栓重量略有下降,APTT显著延长,降低纤维蛋白酶原、延长凝血时间,以Mes-ATP为参照阈值(对接得分-5.150),FDDP共有23个活性组分与抗血小板聚集靶酶存在结合效应。长期100天结果显示,各给药组均可在一定程度上降低白细胞、红细胞、血小板指标,延长血凝参数TT、APTT、PT,降低血液粘度,合用组较各单独给药组相比较,上述作用增强,并筛选出中性粒细胞百分比、TT等10个指标与各单独组比较有统计学差异。5.FDDP方中活性组分具有较好的结构多样性分子特征,选择了 27个血小板聚集相关靶酶,其中Ramachandran plot结果显示同源模建构建蛋白PAFR、5LO氨基酸残基90%以上处于合理区;虚拟筛选结果显示丹参、三七与凝血、炎症类靶点间有作用效应分子较多,并筛选出菲醌、黄酮、多酚、皂苷类二十个化合物与血小板聚集靶酶结合较好,组分-靶点网络分析结果显示FDDP中存在一个组分与多个靶标、不同组分作用同一个靶点蛋白作用特征。结论1.平衡透析法和分子对接实验结果表明CPG对FDDP活性组分Rg1、Rb1存在一定程度的竞争结合效应,合并使用氯吡格雷可以降低FDDP蛋白结合率。2.分析对接结果揭示FDDP与CPG代谢酶CES1、CYP450 3A4、CYP4502C19、CYP450 1A2、CYP450 2B6在整体水平上存在一定的作用效应。3.合并给予CPG使得FDDP活性成分在体内驻留时间延长;CPG单独组会产生蓄积,合并FDDP具有降低CPGS蓄积效应,且合并组不产生蓄积现象。4.在心血管相关联的指标参数中,FDDP、CPG联用可在血凝参数、血栓、血液流变学、血细胞参数等指标层面具有协同抗血小板聚集效应。5.FDDP与各心血管靶点均有一定的潜在协同效应,从分子层次上阐释了系统虚拟药理学的药效物质基础和多靶点作用效应。综上所述,FDDP可在蛋白结合率、代谢酶、药代动力学、药效协同等方面,多角度、多层面增强CPG抗心血管疾病效应。