甾体激素类药物是临床应用中的一类重要药物,在炎症治疗、湿疹、哮喘、风湿病及激素依赖性肿瘤方面发挥了重要作用。以薯蓣皂素开环及环氧化所得中间体16α,17α-环氧黄体酮为底物,经微生物在11α引入羟基,是生产皮质激素药物的重要前体。11α-羟基化转化率的高低严重影响着甾体激素类药物的生产成本。黑根霉(Rhizopus nigricans)是甾体11α-羟基化的主要生产用菌种,其中生物羟化的主要酶为P450酶系中的细胞色素氧化酶(CYP)和细胞色素氧化还原酶(CPR)。为提高黑根霉11α-羟基化转化率,本文探索了将米根霉的CYP和CPR基因导入黑根霉LH21中构建高转化率工程菌。主要结果如下:1.根据米根霉(R.Oryzae)RA 99-880的CYP509C12和RoCPR1的基因序列信息,从米根霉AS3.4826菌株中克隆得到CYP和CPR基因。米根霉AS3.4826的CYP基因的氨基酸序列与CYP509C12的相似性为96.96%,CPR基因的氨基酸序列与RoCPR1的相似性为98.74%。2.将米根霉AS3.4826的CYP和CPR基因分别与质粒pEGFP-C1构建了三个表达载体:CYP与绿色荧光蛋白基因GFP融合表达载体pEGFP-CYP、CYP单独表达载体pC1-CYP和CPR单独表达载体pC1-CPR。3.利用脂质体介导法将三个表达载体分别转化黑根霉LH 21,获得了稳定的转化子。4.经半定量分析和沃氏氧化物的C1 1α-羟基化转化实验,筛选到9个高转化率的CYP转化子,在底物投料量为1%时,转化率比出发菌株提高了 7.08%～9.9%。综上所述,将米根霉的细胞色素氧化酶(CYP)和细胞色素氧化还原酶(CPR)基因导入黑根霉中,能够显著提高黑根霉对16α,17α-环氧黄体酮的11α-羟基化转化率。