目的：本研究拟采用细胞培养、免疫印迹等方法，观察八肽胆囊收缩素(octopeptide-cholecystokinin，CCK8)刺激小鼠神经元后，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)磷酸化水平的改变，并分析CCK8刺激神经元不同时间点，EGFR磷酸化的动力学特征，以获得CCK8与EGF信号转导途径交叉对话(cross talk)的相关信息。 方法： 1、体外培养小鼠皮质神经元。取出生1～2d的乳小鼠大脑皮质，经胰蛋白酶消化分离后，加入DMEM-F12培养基培养，24h后改用神经元培养基Neurol Medium和B27培养，5～7d后可获得形态典型、高密度的神经元。 2、用神经特异性烯醇化酶(neurone specific enolase，NSE)免疫组织化学方法对神经元进行鉴定。待细胞生长至第7d，将其固定、封闭后加入一抗NSE、生物素化山羊抗小鼠IgG二抗结合，用DAB显色后显微镜下观察结果并拍照。 3、CCK8、EGF刺激后，神经元EGFR磷酸化状态分析。将培养的细胞随机分成实验组和对照组，实验组分别采用CCK8(10-7mol/L)、EGF(40ng/ml)、CCK8(10-7mol/L)+EGF(40ng/ml)刺激神经元，对照组采用等量培养基，刺激5min后裂解细胞，提取蛋白质，进行SDS-PAGE凝胶电泳，用抗磷酸化EGFR抗体进行免疫印迹，用Qutity One软件对免疫印迹结果图象进行灰度扫描，以β-action蛋白作为内参照进行标准化，并分析组间结果是否存在差异。 4、CCK8刺激EGFR磷酸化的动力学分析。CCK8(10-7mol/L)刺激神经元不同时间(0、3、5、10、30min)后，液氮中止反应，裂解细胞，提取蛋白质，按上述方法进行EGFR的磷酸化分析，比较各个时间点磷酸化水平的改变，并绘制时间动力学曲线。 结果： 1、Neurol Medium和B27培养基中因有多种生长因子，可选择性的促进神经元生长，抑制胶质生长，用其培养的新生鼠大脑皮质5-7d后在显微镜下可见形态典型、生长良好、密度高、较为纯化的神经元。 2、对培养的细胞采用神经元标志物烯醇化酶(NSE)进行免疫组织化学鉴定，结果显示大多数细胞染色呈阳性反应，可以确定为神经元。 3、神经元提取蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，可见谱带整齐，没有拖尾和弥散，在分子量170KD处可见清晰的EGFR谱带，免疫印迹后可以得到清晰的磷酸化EGFR谱带，表明本研究所建立的小鼠神经元磷酸化蛋白质的检测方法是成功的。 4、分别用CCK8、EGF、CCK8+EGF刺激神经元后，免疫印迹分析结果显示上述不同刺激后EGFR磷酸化水平存在差异(P<0.05)，与对照组比较，CCK8、EGF分别刺激后EGFR的磷酸化水平均增强，但是CCK8+EGF刺激后则更为显著，表明CCK8可刺激EGFR的磷酸化，且存在和EGF的协同作用。 5、CCK8刺激神经元0、3、5、10、30min后得到EGFR磷酸化水平的时间动力学曲线呈峰型，5min达到最高，之后开始下降，30min时曲线又有轻微地上扬，表明CCK8刺激EGFR磷酸化可能存在快速和迟发的不同机制。 结论： 1、本研究成功地建立了小鼠神经元EGF受体磷酸化的免疫印迹分析方法； 2、CCK8可导致神经元中EGFR磷酸化水平改变，表明中枢神经系统中CCK8与EGF信号转导途径之间存在cross talk，这种不同信号分子之间的相互交流可能成为CCK8复杂生物学功能的基础。 3、CCK8刺激神经元EGFR磷酸化的动力学曲线为峰型，且具有与EGF刺激不同的动力学特征。