研究背景及研究目的:Shh信号通路的异常激活与髓母细胞瘤等多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。近年来,Shh信号通路抑制剂的开发已成为抗肿瘤药物研究的热点。根据“髓母细胞瘤的发生发展与Gli3负反馈调节失衡密切相关”,我们以Gli3 processing为靶点,建立了高通量药物筛选模型,并采用“老药新用”策略,从上市药物库中筛选出了 5种可能能够促进Gli3 processing的活性化合物——苄索氯铵、青蒿琥酯、双氢青蒿素、洋地黄皂苷、阿法替尼。在进一步的抗肿瘤药效研究中,我们发现苄索氯铵能够显著抑制MB敏感/耐药细胞株的增殖及Shh信号通路的转导。因此我们首先对苄索氯铵的抗肿瘤药效及药理作用机制进行了深入系统的研究。药效研究表明,苄索氯铵能够显著抑制原代MB细胞在体外的增殖,机制研究发现苄索氯铵可能是通过提高蛋白激酶A（PKA）的活性来促进Gli3 processing从而抑制Shh信号通路及肿瘤增殖。体内研究也表明其能够显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤生长。此外,我们筛选出的另外4种活性化合物青蒿琥酯、双氢青蒿素、洋地黄皂苷、阿法替尼的抗肿瘤药效及机制研究也正在进行中。研究方法:1.借助293T细胞包装Cre-YFP慢病毒,侵染MEF（Ptch1fl/fl）细胞,得到Ptch1基因敲除的细胞株MEF（Ptch1-/-）,该敏感模型可用于模拟原发MB肿瘤;借助293T细胞包装SmoA1慢病毒,侵染胎鼠的MEF细胞,构建过表达SmoA1（SMO活化突变体,对SMO抑制剂耐药）的工具细胞株MEF（SmoA1）,该耐药模型可用于模拟MB耐药肿瘤;借助293T细胞包装Gli3FL-GFP慢病毒,侵染293FT细胞,构建过表达Gli3FL-GFP的细胞株293FT（Gli3FL）。2.第二轮筛选:（1）采用第一轮筛选（筛选模型:293FT细胞中转染Gli3FL-GFP,筛选指标:化合物处理后体系的相对荧光强度。该部分研究工作详见2016级研究生江锦宜的论文,本文作者协助江锦宜共同完成第一轮筛选）获得的30种活性化合物分别处理MEF（Ptch1-/-）细胞株和MEF（SmoA1）细胞株,qPCR检测Shh信号通路靶基因Gli1的mRNA水平,筛选出能够抑制两种模型中Shh信号通路的活性化合物。（2）细胞毒性实验:筛选出的活性化合物处理HEK293FT细胞后检测细胞活力,排除由于毒性作用引起荧光下降的化合物。3.活性化合物在MB敏感/耐药细胞株中的药效研究（1）检测活性化合物对MB（敏感株）和MB（SmoA1）细胞株（耐药株）中的Shh信号通路（qPCR检测靶基因Gli1,Ptch2）的抑制作用。（2）检测活性化合物对MB和MB（SmoA1）细胞株细胞增殖能力的抑制作用（CCK-8 法）。（3）检测活性化合物对MB和MB（SmoA1）细胞株集落形成能力的影响。4.体外评价活性化合物的抗肿瘤药效提取原代髓母细胞瘤细胞,体外给予活性化合物处理:（1）检测活性化合物对原代MB细胞增殖的抑制作用（CCK-8法及免疫荧光法）。（2）检测活性化合物对原代MB细胞Shh信号通路的抑制作用（qPCR检测靶基因 Gli1,Ptch2）。5.探究活性化合物抑制Shh信号通路的机制（1）不同浓度梯度的活性化合物处理293FT（Gli3FL）稳转株,酶标仪检测体系中荧光强度,检测活性化合物是否能够浓度依赖性地促进体系中的荧光下降。（2）活性化合物处理293FT（Gli3FL）稳转株或原代MB细胞48 h,Western Blot检测Gli3的蛋白水平,验证活性化合物促进细胞体系中Gli3 processing的能力。（3）活性化合物处理原代MB 48 h,采用Elisa试剂盒检测体系中PKA的活性。6.体内评价活性化合物的抗肿瘤药效SCID小鼠皮下接种原代提取的MB细胞,肿瘤体积达到200 mm3—300 mm3时,给予活性化合物两周,通过检测肿瘤体积的变化来评价活性化合物的体内抗肿瘤药效。研究结果:1.通过第二轮筛选,我们得到了 5种既能够抑制MEF（Ptch1-/-）细胞株又能够抑制MEF（SmoA1）细胞株中Shh信号通路的化合物。且这5种活性化合物在10 μM的浓度下,对HEK293FT细胞毒性很小,这表明这5种化合物可能是通过促进Gli3 processing抑制了 Shh信号通路。2.在MB细胞株中我们发现苄索氯铵对其增殖能力的抑制作用最强,因此首先选择苄索氯铵进行深入的抗肿瘤药效和机制研究。3.在苄索氯铵克服SMO抑制剂耐药的研究中,我们发现苄索氯铵能够抑制野生型MB细胞株和耐药型MB细胞株中的Shh信号通路,并且能够浓度依赖性地抑制两种细胞株的增殖。4.体外实验表明苄索氯铵能够抑制原代髓母细胞瘤细胞的增殖和Shh信号通路。5.在机制研究中,我们发现苄索氯铵能够促进过表达体系（293FT（Gli3FL）稳转株）和内源性体系（原代MB细胞）中的Gli3 processing,并且在内源性体系中能够提高PKA的活性。这说明苄索氯铵可能是通过提高PKA的活性来促进Gli3 processing 的。6.基于皮下荷瘤鼠的体内实验表明苄索氯铵可以显著抑制皮下瘤的增殖及Shh信号通路。7.青蒿琥酯、双氢青蒿素、洋地黄皂苷、阿法替尼能够浓度依赖性地抑制293FT（Gli3FL）中的荧光强度,能够显著抑制MB细胞株的增殖以及MB敏感/耐药细胞株中Shh信号通路。8.机制研究结果表明双氢青蒿素和洋地黄皂苷能够在过表达体系（293FT（Gli3FL）稳转株）体系中显著促进Gli3 processing。研究结论:在前期研究中,通过高通量的药物筛选,本课题组从1700种化合物中筛选出了30种可能促进Gli3 processing的化合物。理论上Gli3位于SMO下游,如果化合物能够促进Gli3 processing,那么它就能够抑制SMO突变型的Shh信号通路。因此我们基于敏感模型和耐药模型的进行了第二轮筛选,该轮筛选将活性化合物的范围缩小到了 5个:苄索氯铵、青蒿琥酯、双氢青蒿素、洋地黄皂苷、阿法替尼,这5个化合物均可以抑制两种模型中的Shh信号通路。在药效研究中,我们发现苄索氯铵对MB细胞株增殖的抑制作用最强,因此我们首先对苄索氯铵进行深入的抗肿瘤药效和机制研究。药效研究证明苄索氯铵既能够抑制敏感型肿瘤细胞株又能够抑制耐药肿瘤细胞株的增殖及Shh信号通路。机制研究发现,苄索氯铵能够提高PKA的活性来促进Gli3 processing从而抑制Shh信号通路。体内实验也进一步证实了苄索氯铵对髓母细胞瘤增殖的抑制作用。这些结果都表明苄索氯铵是具有克服SMO抑制剂耐药潜能的新型Shh信号通路抑制剂,有望用于治疗敏感型和耐药型的髓母细胞瘤。此外,我们针对青蒿琥酯、双氢青蒿素、洋地黄皂苷、阿法替尼的抗肿瘤药效及机制研究也正在进行当中,这4种活性化合物可以显著抑制MB敏感/耐药细胞株中的Shh信号通路,且双氢青蒿素、洋地黄皂苷能够促进Gli3 processing,这些结果表明双氢青蒿素、洋地黄皂苷也有望成为新型的Shh信号通路抑制剂用于髓母细胞瘤的治疗。