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本课题组在前期研究中利用靶基因敲除技术已创制了CWI-MAPK级联途径中的MAPKKK基因StBCK1的敲除突变体，并将其分别命名为△StBCK1-1、△StBCK1-2。本研究拟在此基础上克隆StBCK1基因，构建该基因的过表达载体，并利用原生质体转化的方法创制该基因过表达突变体，进一步对野生型菌株(WT)、基因敲除突变体及过表达突变体进行比较，明确该基因对病菌生长发育、细胞壁完整性、致病力及高渗胁迫反应的影响，主要研究结果如下: 1.StBCK1基因的克隆及生物信息学分析。本研究克隆了StBCK1基因，DNA全长为5064bp，不含内含子;编码1687个氨基酸，在多肽链的N端的1396-1655aa处有1个S TKc保守结构域。 2.StBCK1基因过表达载体的构建及过表达突变体的获得。分别扩增StBCK1及GFP的ORF序列并将其连接到pBARKSⅠ载体骨架上，构建了基因过表达载体，并命名为StBCK1-GFP-pBARKSⅠ。利用原生质体转化方法创制基因过表达突变体，并通过草胺膦抗性筛选、BAR及GFP基因引物的PCR、绿色荧光、qPCR验证，最终得到3株突变体，分别命名为StBCK1-OE1、StBCK1-OE2、StBCK1-OE3。 3.StBCK1基因参与调控病菌的菌丝及分生孢子的发育。通过比较突变菌株与野生型菌株的生长发育特征，发现该基因敲除突变体菌丝颜色为灰白色，菌落生长速率减慢，菌体生物量增大，基生菌丝细胞缩短变粗，分生孢子产量降低，孢子体积变小、颜色变浅;而过表达突变体菌丝颜色为白色，菌落生长速率较野生型菌株变慢，且比敲除突变体慢，菌体生物量与WT无显著性差异，基生菌丝细胞长度增加、宽度不变，但不产生分生孢子。 4.StBCK1基因参与调控病菌细胞壁的发育。研究发现，突变体细胞中细胞壁组分及结构与WT相比均发生显著变化。①基因敲除和过表达突变体的β-葡聚糖含量均显著增加，其中过表达突变体增加程度更高;敲除和过表达突变体的几丁质含量均显著降低，其中过表达突变体含量更低。②敲除突变体细胞壁变薄，过表达突变体细胞壁变薄且形状弯曲。③通过比较突变体与WT对细胞壁合成干扰物质的敏感性发现，用100μg/mL刚果红处理时，基因敲除和过表达突变体对刚果红的敏感性均降低，其中过表达突变体的敏感性更低;用20μg/mLCFW处理时，基因敲除突变体对CFW的敏感性降低，而过表达突变体的敏感性比野生型低，但高于敲除突变体。 5.StBCK1基因参与调控病菌附着胞的发育及HT-毒素活性。研究发现，该基因敲除突变体在36h开始大量形成成熟附着胞，48h可以穿透玻璃纸，与WT菌株相比附着胞形成时间延迟12h;而过表达突变体附着胞形成时间提前12h，不能穿透玻璃纸;对突变体的HT-毒素活性分析发现，与WT菌株相比，敲除突变体的HT-毒素活性没有明显变化，而过表达突变体的HT-毒素活性丧失。 6.StBCK1基因参与调控病菌对高渗胁迫的反应。在0.4MNaCl的高渗胁迫条件下，与WT相比，基因敲除突变体对氯化钠引起的高渗胁迫反应敏感性增强，而过表达菌株敏感性降低;在1M山梨醇的胁迫条件下，与WT相比，基因敲除突变体对高渗山梨醇胁迫的敏感性降低，而过表达菌株敏感性升高。