目的胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。尽管胃癌的辅助化疗取得了一定的进展,但目前使用的化疗药物仍缺乏理想的治疗效果且毒副作用较大。因此需要研发既有抗癌活性且毒副作用低的新型抗肿瘤药物,尤其是从天然产品中提取有效活性成分已成为一种新的趋势。苦参碱是从传统中药苦参中提取的一种生物碱,具有广泛的药理作用。本实验的目的是研究苦参碱对胃癌SGC-7901细胞的作用,阐明自噬和凋亡在苦参碱治疗胃癌过程中的作用,并进一步证明苦参碱诱导细胞自噬发生的信号转导通路,为中药单体及联合用药治疗胃癌提供实验依据。方法用SRB法检测细胞活力,流式细胞术检测苦参碱对细胞周期的影响。Annexin-V-FITC/PI双染检测不同浓度苦参碱对细胞凋亡的诱导作用。用倒置相差显微镜观察苦参碱干预后SGC-7901细胞的形态学改变,并用透射电镜进一步观察细胞的超微结构变化。同时用MDC染色后通过荧光显微镜鉴定自噬的发生。应用western blot检测自噬分子标记物LC3表达水平,从分子生物学水平检测细胞自噬水平的改变。用自噬抑制剂、自噬诱导剂、凋亡抑制剂分别联合苦参碱干预胃癌细胞,调控苦参碱诱导的自噬和凋亡,用’PI染色检测其对苦参碱诱导的胃癌细胞死亡率的影响,最后用western blot检测PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路的相关分子是否参与苦参碱诱导的自噬过程,并用实时定量RT-PCR检测促凋亡基因Bax和自噬相关基因Beclin1的mRNA表达水平。结果苦参碱能显著抑制SGC-7901细胞增殖,呈时间剂量依赖性,并将SGC-7901细胞阻滞在细胞周期的G0/G1期。Annexin-V-FITC/PI双染结果显示苦参碱以剂量依赖性诱导细胞凋亡,与对照组相比,当用0.5、1.0和2.0mg/ml的苦参碱处理SGC-7901细胞后,凋亡率分别显著上升至72.92±3.41%、77.75±2.19%和83.28±2.75%。倒置相差显微镜观察到苦参碱干预后显著的细胞形态学改变,在细胞质中可见大量的大小不等的空泡,而且随着苦参碱浓度的增加胞质中的空泡逐渐增大增多。透射电镜进一步证实苦参碱干预后的SGC-7901细胞内有大量自噬泡形成。MDC染色荧光显微镜检测可见苦参碱组比未处理组显示更强的荧光信号和更多的MDC标记颗粒(?)Western blot结果显示苦参碱诱导胃癌细胞LC3-Ⅱ表达水平以时间和剂量依赖性增加,并且为苦参碱增强细胞自噬活性而非抑制自噬体降解所导致的LC3-Ⅱ增高。PI染色流式细胞仪检测显示细胞死亡率随着苦参碱浓度的增加而增高,用自噬抑制剂3-MA或巴弗洛霉素A1联合干预后,苦参碱诱导的细胞死亡率进一步增加,并且在透射电镜下可见到部分苦参碱干预细胞出现典型的凋亡形态学改变并且细胞内自噬泡减少,Annexin-V-FITC/PI双染结果进一步证实抑制自噬能增加苦参碱诱导的凋亡,并且自噬抑制剂能明显增加苦参碱对胃癌细胞增殖的抑制作用。用caspase抑制剂或自噬诱导剂联合干预降低了苦参碱诱导的细胞死亡率。Western blot检测结果显示苦参碱干预后,尽管总Akt和总mTOR表达水平轻度降低,但Akt (Ser473)磷酸化水平以时间和剂量依赖性增高,其下游效应分子mTOR (Ser2448)和p70S6K (Thr389)的磷酸化水平也轻度增高。实时定量RT-PCR显示苦参碱上调促凋亡基因Bax和自噬基因Beclin1的mRNA表达水平。结论苦参碱对胃癌具有显著的抗肿瘤活性,而且苦参碱诱导胃癌细胞死亡时凋亡和自噬均被激活。自噬是胃癌细胞的适应性反应,促进了细胞存活,抑制自噬能够增强苦参碱诱导的细胞凋亡,因此联合自噬抑制剂是进一步提高苦参碱抗肿瘤作用的有效策略。另外,PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路可能未参与苦参碱诱导的自噬过程。