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目的： 为了增加sTNFRⅡ-adiponectin融合蛋白多聚体的形成和分泌，对sTNFRⅡ-adiponectin基因进行改构。一方面是在sTNFRⅡ基因和adiponectin基因之间加入一段连接肽(linker)，即构成sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白。另一方面是利用44kDa的内质网蛋白(endoplasmic reticulum protein44，ERP44)能滞留新合成的脂联素单体，并可以在细胞内形成三聚体、六聚体和高分子量多聚体的特点，合成后的脂联素借助ERP44和内质网氧化还原酶1-Lα(endoplasmicoxidoreductin1 like protein，Ero1-Lα)以调节型的方式分泌到细胞外。通过这两种方法旨在构建一种以三聚体、六聚体和多聚体为主的新型双功能融合蛋白，从而增加肿瘤坏死因子受体Ⅱ与TNFα的亲和力;同时利用富含“GC”的真核载体快速高效表达蛋白，初步探索了无血清悬浮流加培养的方法，为进一步优化快速、高效表达相关融合蛋白的大规模无血清悬浮流加培养工艺奠定了良好的基础。 方法： 1.获取ERP44和sTNFRⅡ-linker-adiponectin基因 ①通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，从人脂肪组织中获得脂联素cDNA，以该cDNA为模板，通过PCR得到ERP44基因。 ②以实验室保存的pMH3-sTNFRⅡ-adiponectin为模板，分别扩增基因sTNFRⅡ和adiponectin，再将连接肽(linker，ACG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGAGGC AGC GGC GGG GGC GGA TCC GGC GAA TTC)和这两段基因进行融合，得到sTNFRⅡ-linker-adiponectin基因。 2.构建表达质粒pCA-ERP44和pMH3-sTNFRⅡ-linker-adiponectin 通过PCR和重组PCR技术分别扩增目的基因ERP44和sTNFRⅡ-linker-adiponectin，将pCA、pMH3载体分别进行双酶切，再通过ClonExpress(@)Ⅱ One Step Cloning Kit(一步法无缝克隆试剂盒)进行连接、转化，得到pCA-ERP44和pMH3-sTNFRⅡ-linker-adiponectin质粒。 3.建立ERP44高表达的sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44) CHO-S细胞株 先通过电转的方法，将成功构建的表达质粒转染至CHO-S细胞中，经G418筛选得到高表达sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT融合蛋白的细胞株。再通过电转的方法，将pCA-ERP44表达质粒转入CHO-S细胞中，经嘌呤霉素筛选得到在细胞内稳定高效表达sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT融合蛋白的细胞株。通过PPARγ激活剂的作用增加sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)融合蛋白的多聚化和分泌，以便获得更高表达量、更高活性的融合蛋白。本文有关的sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)融合蛋白指的均是指在ERP44和罗格列酮作用下表达出来的融合蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT。 4.建立高效表达sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白的CHO-S细胞株 通过电转的方法，将构建成功的表达质粒转染至CHO-S细胞中，经过G418筛选得到稳定高效表达sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白的细胞株。 5.sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白的获取 5.1贴壁培养 ①经抗生素筛选（先用G418筛选，再用嘌呤霉素筛选）出的高表达细胞株于T75平皿中贴壁培养，通过PPARγ激活剂（罗格列酮）增加脂联素的转录和蛋白的分泌，PPARγ激活后能诱导Ero1-Lα表达，然后Ero1-Lα与ERP44结合，促使被滞留在细胞内的高分子量脂联素分泌到细胞外。最后通过收集细胞上清，利用镍柱纯化获取目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)，透析过夜后用超滤管对蛋白进行浓缩，并通过Western-blot、考马斯亮蓝染色法来鉴定目的蛋白大小。 ②将筛选出高效表达目的蛋白的细胞株于T75中贴壁培养，收集细胞上清，利用镍柱纯化获取目的蛋白sTNFRⅡ-linker-adiponectin，透析过夜后用超滤管对目的蛋白进行浓缩，并通过Western-blot、考马斯亮蓝染色法来鉴定目的蛋白大小。 5.2悬浮培养初探 将T75中贴壁培养的高表达目的蛋白的细胞株用B001培养基进行悬浮驯化，得到适合悬浮生长的稳定高效表达目的蛋白的工程细胞株。 6.sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白活性的测定 通过CCK-8试剂盒检测目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin中和TNF-α杀伤L929细胞的活性，比较目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)、 sTNFRⅡ-linker-adiponectin、sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT和标准品sTNFRⅡ-Fc拮抗TNFα的能力的差异。 结果： 1.成功得到了ERP44和sTNFRⅡ-linker-adiponectin基因 ①以人脂联素的cDNA为模板进行PCR，用1％的琼脂糖检测结果，成功得到与预期条带大小一致的片段。 ②将PCR得到的基因sTNFRⅡ、adiponectin和linker进行重叠PCR，用1％的琼脂糖检测结果，成功得到与预期条带大小一致的片段。 2.成功构建质粒了pCA-ERP44和pMH3-sTNFRⅡ-linker-adiponectin 提取质粒并进行酶切，用1％的琼脂糖鉴定酶切结果，得到与预期大小相符的条带，将该质粒送测序鉴定目的基因，与NCBI上获取的基因序列比对后完全一致，提示成功构建pCA-ERP44和pMH3-sTNFRⅡ-linker-adiponectin。 3.在ERP44高表达的CHO-S细胞株中成功表达出了融合蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44) 通过电转的方法，将pCA-ERP44表达质粒转染至CHO-S细胞中，经嘌呤霉素(puromycin)筛选得到在细胞内高表达sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)融合蛋白的细胞株。经PPARγ激活剂（罗格列酮）处理后，对细胞内sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)融合蛋白的表达起到一定调控的作用。 4.成功在CHO-S细胞中表达出了sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白 电转后的细胞经G418加压筛选后，通过Dot-Blot筛选出高表达细胞株，经过3轮抗生素筛选后，挑选表达量较高的细胞株进行扩增培养，得到了高效表达目的蛋白的细胞株。 5.sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白的纯化 镍柱纯化时，目的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin的咪唑洗脱浓度分别在130mM和235mM左右，纯化后成功得到目的蛋白。经过WB鉴定，目的蛋白的单体大小均在70kDa左右，并且以多聚体的形式存在为主。 6.sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白活性的测定 sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT(ERP44)和sTNFRⅡ-linker-adiponectin融合蛋白均具有显著抑制TNFα杀伤L929细胞的活性，且随蛋白浓度的升高，抑制TNFα杀伤L929细胞越明显。结果表明目的蛋白活性均强于标准品sTNFRⅡ-Fc和实验室保存的蛋白sTNFRⅡ-adiponectin-WT/MT。 结论： 本实验成功构建了质粒pCA-ERP44，通过PPARγ激活剂（罗格列酮）增加了脂联素的转录和目的蛋白的分泌，PPARγ被激活后可以诱导Ero1-Lα表达，然后Ero1-Lα与ERP44结合，能促使被滞留在细胞内的高分子量脂联素分泌到细胞外。同时在CHO-S细胞中也得到了目的蛋白表达，并筛选出了高表达目的蛋白的单克隆细胞株。收取细胞上清，经镍柱纯化获得具有一定体积并测得具有较好活性的融合蛋白。 同时本实验成功构建了sTNFRⅡ-linker-adiponectin真核表达载体，在CHO-S细胞中也检测到了目的蛋白表达，并且筛选出高效稳定表达目的蛋白的细胞株。收取细胞上清，经镍柱纯化后也得到了一定体积的目的蛋白并测得具有较好的生物活性。