研究背景:　　 结直肠癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,随着人们生活水平的提高以及生活方式的改变,结直肠癌的发病率呈逐年上升的趋势。侵袭转移是结直肠癌治疗失败导致患者死亡的最主要因为。因此,探讨与结直肠癌发生发展、诊断治疗密切相关的因素势在必行。　　 恶性肿瘤的发生发展是一个多因素、多步骤的过程。近年来上皮间质转化(epithelial—mesenchymal transition,EMT)成为肿瘤研究中的热点,它是指在生理或者病理情况下上皮细胞向间充质细胞转化的过程。EMT在形态方面主要表现为:1)细胞极性的丧失；2)细胞形态变梭；3)伸出丝状伪足；4)获得侵袭运动能力；在分子生物学方面表现为:1)上皮性标志物,如 E钙黏蛋白(E-cadherin)、角蛋白(Cytokeratin)等的表达降低或缺失；2)间质性标志物,如波形蛋白(Vimentin)、N钙黏蛋白(N-cadherin)等的表达增加。目前已有大量文献报道众多的信号通路和细胞因子参与了 EMT的过程,如 MAPK通路、Wnt通路、NF-kB通路、TGF-β、SNAI1、SNAI2、Twist、ZEB1、ZEB2等,这些信号通路和细胞因子并非各自孤立存在的,而是存在相关性的。MMP2是基质金属蛋白酶家族(matrix metallo proteinase,MMPs)的成员,它可以降解Ⅳ型胶原和明胶,调节肿瘤细胞的粘附作用,从而影响肿瘤的浸润转移:TIMP2是组织金属蛋白酶抑制物家族(tissue inhibitor of metallo proteinase,TIMPs)的成员,它可以与MMP2结合,从而抑制后者的产生及活性,二者相互作用,在肿瘤的浸润转移中发挥作用。近年来的研究表明,T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tlymphoma invasion and metastasis inducing factor1,Tiaml)是鸟苷酸转换因子家族成员,它可以参与肿瘤的发生发展和浸润转移。　　 SNAI1是近年 EMT中的研究热点,它是一种锌指转录抑制因子,属于锌指转录因子家族成员之一,这个家族成员还有 SNAI2、E12/E47、ZEB1、SIP1等,其家族成员具有相似的结构,由一个高度保守的羧基末端及一个高度可变的氨基末端构成,差异主要表现在中间P—S富集区域。SNAI1可以与编码 E-cadherin的CDH1基因启动子区域的 E-box结合,抑制 E-cadherin的表达,从而促进 EMT的发生。众多的信号通路及细胞因子可以作用于 SNAI1,继而SNAI1影响下游的 EMT重要标志物 E-cadherin的表达。研究报道,SNAI1与多种恶性肿瘤的发生发展过程有关,其中,SNAI1的高表达与甲状腺癌密切相关,SNAI1的表达促进胰腺癌的转移及化疗药物抵抗性,SNAI1还可以独立地作为浅表膀胱癌复发的预测指标。本文初步研究了 SNAI1在结直肠组织中的表达,结合课题组前期 EMT标志物 E-cadherin、Vimentin的表达情况,分析了SNAI1在结直肠癌中的表达及意义。　　 曾经被认为“基因垃圾”的微小 RNA(MicroRNA,miRNA)逐渐被研究者重视,成为肿瘤研究的另一热点。miRNA是一类长约17-25个核苷酸(nucleotide,nt)的单链非编码 RNA,它广泛存在于真核细胞中,在转录后水平调控基因的表达,与组织器官发育、细胞分化和凋亡、胰岛素分泌、脂肪代谢等生命活动密切相关,其异常表达可能影响恶性肿瘤的发生发展。miRNA的形成过程:首先在细胞核中形成初级 miRNA(Pri-miRNA),然后在Drosha酶的作用下形成前体miRNA(Pre-miRNA),随后在转运蛋白的作用下运输至细胞浆,在Dicer酶的作用下形成 miRNA的双链结构,该双链结构不稳定,很快解链形成成熟的miRNA,成熟miRNA与RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)结合形成一个复合物,此复合物可以与靶基因 mRNA的3’-非编码区(3’-untranslated region,3’-UTR)以完全或者不完全互补配对的方式结合,降解或者抑制靶基因mRNA。miRNA与基因之间的作用是错综复杂的,一个 miRNA可以调控多个基因的 mRNAs,一个基因的mRNA也可以由多个miRNAs调控,此外,基因也可以参与对miRNAs的调控。　　 miR-200a,全长22nt,属于miRNA-200家族(包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-429)中的成员。已有较多文献报道 miR-200b/c在恶性肿瘤发生发展中的作用,但是较少文献报道 miR-200a在恶性肿瘤中的作用,目前尚没有文献阐明 miR-200a在结直肠癌中的作用及机制。本研究首先检测了miR-200a在结直肠组织及结直肠癌细胞株中的表达情况,然后通过瞬时转染的方法分别下调结直肠癌 HCT116细胞中 miR-200a的表达和上调结直肠癌LoVo细胞中 miR-200a的表达,研究 miR-200a对HCT116细胞/LoVo细胞的生物学影响。　　 为了深入了解结直肠癌发病的分子机制和寻找新的治疗靶点,本课题着重进行了如下研究,来探讨SNAI1和 miR-200a在结直肠癌EMT中的作用。　　 目的:　　 1、探讨SNAI1在结直肠组织中的表达情况,并结合课题组前期 EMT标志物E-cadherin和 Vimentin研究结果分析SNAI1在结直肠癌中的意义；　　 2、探讨 miR-200a在结直肠组织和不同恶性程度结直肠癌细胞株中的表达情况,分析miR-200a的表达及意义；　　 3、探讨通过瞬时转染抑制/上调miR-200a的表达对HCT116细胞/LoVo细胞生物学行为的影响。　　 方法:　　 1、免疫组织化学检测:应用免疫组织化学二步法检测 SNAI1在85例结直肠癌患者组织中的表达情况,结合课题组前期检测的 EMT重要标志物 E-cadherin和Vimentin的表达情况进行综合分析。　　 2、应用实时荧光定量PCR(quantitive real time PCR,qRT-PCR)方法检测正常结直肠组织和不同分化程度直肠癌组织中miR-200a的表达情况,并检测6株不同恶性程度结直肠癌细胞株中miR-200a的表达情况,确定miR-200a表达最高和最低的细胞株,用于后续实验。　　 3、将inhibitor/miR-200a瞬时转染入结直肠癌HCT116细胞株来抑制miR-200a的表达,通过实时荧光定量PCR检测抑制效果,然后进行 HCT116细胞的划痕实验及Transwell实验来检测细胞的迁移运动能力；实时荧光定量PCR检测EMT相关基因(E-cadherin、Vimentin、Tiam1、SNAI1、MMP2、TIMP2)在mRNA水平的表达变化；细胞滴片免疫化学方法检测细胞中EMT相关基因及凋亡增殖相关基因(E-cadherin、Vimemin、Caspase-3、Ki-67)在蛋白水平的表达变化。　　 4、将mimics/miR-200a瞬时转染入结直肠癌LoVo细胞株来上调miR-200a的表达,通过实时荧光定量PCR检测上调效果,然后进行LoVo细胞的划痕实验及Transwell实验来检测细胞的迁移运动能力；细胞滴片免疫化学方法检测细胞EMT相关基因及凋亡增殖相关基因(E—cadherin、Vimentin、Caspase-3、Ki-67)在蛋白质水平的表达变化；MTT法检测LoVo细胞的增殖情况。　　 结果:　　 1、SNAI1及EMT标志物在结直肠组织中的表达情况及关系SNAI1在正常结直肠组织、结直肠癌原发灶及淋巴结转移癌组织中的表达显著不同,差异具有统计学意义(x2=50.496,P=0.000)。两两比较发现,SNAI1在结直肠癌原发灶中的表达显著高于在正常结直肠组织中的表达(Z=-6.018,P=-0.000)；淋巴结转移癌组织中的表达显著高于结直肠癌原发灶(Z=-3.446,P=0.001)；低分化癌组织中的表达显著高于高中分化癌组织(Z=-2.467,P=0.014)。相关分析结果显示,SNAI1的表达与EMT重要上皮性标志物E-cadherin的表达呈显著负相关(r=-0.420,P=0.000),与EMT重要间质性标志物Vimentin的表达呈显著正相关(r=0.215,P=0.011)。　　 2、miR-200a在结直肠组织和6株结直肠癌细胞株中的表达情况miR-200a在结直肠组织中的表达存在显著性差异(F=31.184,P=0.000)。两两比较显示,miR-200a在低分化结直肠癌组织中的表达显著低于高中分化癌组织(P=0.003)；高中分化结直肠癌组织中的表达显著低于正常结直肠组织(P=0.000)。与患者性别、年龄、Dukes分期、淋巴结转移无关。miR-200a在6株结直肠癌细胞株中的表达有显著性差异(F=762.748,P=0.000),随着细胞恶性程度的增强,miR-200a的表达逐渐减弱,其中HCT116细胞中miR-200a的表达最高,LoVo细胞中miR-200a的表达最低。　　 3、抑制miR-200a的表达对HCT116细胞的影响下调结直肠癌细胞株HCT116中miR-200a的表达,实时荧光定量PCR检测抑制效率约为67％。划痕实验显示,下调miR-200a的表达后,HCT116细胞的迁移能力较对照组显著增强；Transwell小室细胞运动实验结果显示,下调miR-200a的表达后,HCT116细胞的穿膜数量较对照组显著增多(t=-12.633,P=0.000)；实时荧光定量PCR检测结果显示,miR-200a的表达下降后,在mRNA水平E-cadherin表达显著下降(t=27.163,P=0.000)、Vimentin的表达显著升高(t=-75.054,P=0.000)；然而,Tiaml(t=1.639,P=0.177)、SNAI1(t=2.211,P=0.158)、MMP2(t=2.572,P=0.062)、TIMP2(t=-2.646,P=0.118)的表达无显著性差异；细胞滴片免疫化学结果显示,下调miR-200a的表达后,HCT116细胞E—cadherin和Caspase-3的表达显著减弱、Vimentin和Ki-67的表达显著增强。　　 4、上调miR-200a的表达对LoVo细胞的影响上调结直肠癌细胞株LoVo中miR-200a的表达,实时荧光定量PCR检测上调7200多倍。划痕实验显示,上调miR-200a的表达后,LoVo细胞的迁移能力较阴性对照组显著减弱；Transwell小室细胞运动实验结果显示,上调miR-200a的表达后,LoVo细胞的穿膜数量较对照组显著减少(t=13.438,P=0.000)；细胞滴片免疫化学结果显示,miR-200a的表达上调后,LoVo细胞E-cadherin和Caspase-3的表达显著增强、Vimentin和Ki-67的表达显著减弱； MTT法检测细胞增殖能力,结果显示,上调miR-200a的表达后,LoVo细胞的增殖能力在转染后24h和48h均显著下降(t24=4.151,P=0.001；t48=4.056,P=0.001)。　　 结论:　　 1、SNAI1与结直肠癌的分化程度和转移有关,它可能通过诱导 EMT来促进结直肠癌的侵袭转移；　　 2、miR-200a的低表达可能参与了结直肠癌的发生发展；miR-200a在结直肠癌中发挥抑癌因子的作用；　　 3、miR-200a的表达可以影响结直肠癌细胞的迁移运动,并且与部分 EMT相关基因在mRNA水平和蛋白水平相关,然而对部分 EMT相关基因在mRNA水平无显著影响,其低表达促进了结直肠癌 EMT的发生发展,miR-200a的表达可以抑制结直肠癌细胞的增殖,促进凋亡。