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前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤,近年来发病率稳步增高。PSA筛查大大提高了前列腺癌的检出率,但也导致了惰性前列腺癌的过诊过治。前列腺癌晚期可发生骨转移,也可进展为去势抵抗性前列腺癌(Castration resistance prostate cancer,CRPC),预后很差。多个基因、多种机制参与前列腺癌的发生发展。其中,去势抵抗和上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transformation,EMT)是非常关键的两个机制,C-MYC 和 SOX4 是至关重要的两个基因。原癌基因C-MYC是一种转录因子,C-MYC失调在多种恶性肿瘤中发挥重要作用。在前列腺癌中,C-MYC可发生扩增和过表达。C-MYC扩增可发生于29%的前列腺癌,患者预后很差。C-MYC过表达在前列腺癌中广泛存在,其与临床病理参数和肿瘤预后之间的关系仍存在争议。SOX4基因是SOX(SRY-related HMG-box)家族中的成员,是一种与发育密切相关的转录因子,参与胚胎发育、干细胞调控和细胞分化。本课题组前期研究发现,SOX4可以促进前列腺癌细胞增殖、迁移和EMT的发生,其表达水平与病人预后不良正相关。本课题采用临床研究和体外实验相结合,辅以生物信息学分析,旨在研究C-MYC和SOX4在促进前列腺癌的恶性进展中是否相互调节,探讨C-MYC/SOX4轴在前列腺癌发展中的重要作用,为前列腺癌研究提供新的思路。方法1.前列腺癌组织内蛋白表达和基因扩增的检测1.1利用公共数据库分析前列腺癌中C-MYC和SOX4的表达特征和相关性;1.2收集齐鲁医院2007～2014年共126例前列腺癌,其中包括105例局限型前列腺癌和21例去势抵抗性前列腺癌,构建组织芯片;1.3采用免疫组织化学法(IHC)检测C-MYC、SOX4和Ki67在前列腺癌组织内的表达;1.4采用荧光原位杂交技术(FISH)检测前列腺癌组织中C-MYC的扩增;1.5采用SPSS软件分析C-MYC过表达的临床病理学意义、C-MYC过表达和扩增的相关性、C-MYC过表达(C-MYC+)和SOX4过表达(SOX4+)的相关性、以及癌症相关死亡率。2.SOX4是C-MYC的直接作用靶点2.1采用qRT-PCR和Western blot检测前列腺癌细胞系内C-MYC和SOX4的表达;2.2采用siRNA敲减研究SOX4对C-MYC表达的影响;2.3采用siRNA敲减和过表达研究C-MYC对SOX4表达的影响;2.4运用生物信息软件预测前列腺癌细胞内C-MYC在SOX4启动子区的结合位点;2.5采用染色质免疫共沉淀(ChIP)检测C-MYC对SOX4启动子区的结合;2.6采用双荧光素酶法明确SOX4是C-MYC的直接作用靶点。3.C-MYC与SOX4的相互作用3.1利用Citrome在线工具获得C-MYC和SOX4的共同靶基因;3.2运用生物信息软件分析C-MYC和SOX4在共同靶基因TSS区的富集情况;3.3体外培养前列腺癌细胞系,采用免疫共沉淀(Co-IP)、siRNA、过表达和Western blot的方法分析C-MYC与SOX4的相互作用;3.4采用siRNA、过表达、MTT、细胞克隆形成、划痕和Transwell实验检测细胞的增殖、迁移和侵袭功能;3.5采用siRNA、过表达和Western blot的方法检测C-MYC和SOX4对前列腺癌细胞EMT表型的影响。4.C-MYC+/SOX4+亚型前列腺癌预后不良4.1采用生物信息学分析公共数据库中去势抵抗性前列腺癌内C-MYC和SOX4的表达;4.2运用生物信息学的方法,分析C-MYC+/SOX4+前列腺癌与去势抵抗性前列腺癌中的差异表达基因;4.3运用基因富集分析(GSEA)的方法,分析公共数据库中C-MYC+/SOX4+亚型前列腺内差异表达基因的富集情况;4.4采用SPSS分析C-MYC+/SOX4+与Ki67的相关性;4.5采用SPSS分析公共数据库和齐鲁医院病例中C-MYC和SOX4表达水平对前列腺癌生存率的影响。结果1.前列腺癌中C-MYC过表达的临床病理学意义1.1 C-MYC过表达发生于23%的前列腺癌病例。其中,16.2%的局限型前列腺癌有C-MYC过表达,57.1%的去势抵抗性前列腺癌有C-MYC过表达。在去势抵抗性前列腺癌中,C-MYC过表达病例所占的比例显著高于局限型前列腺癌(P<0.001):1.2 C-MYC扩增发生于16.8%的前列腺癌病例,与蛋白过表达显著相关(P<0.001)。在TCGA(The cancer genome atlas,癌症基因图谱)前列腺癌数据库中,C-MYC扩增的病例中mRNA表达水平更高(P<0.05);1.3 C-MYC 过表达与高Gleason 评分(P=0.012)、高 Ki67 增殖指数(P=0.002)和临床分期(P=0.056)显著相关;1.4 C-MYC过表达与癌症相关性死亡率相关(P=0.018),是预后不良的指标之一。2.前列腺癌中SOX4是C-MYC的直接作用靶点2.1 在前列腺癌数据库(TCGA,GSE35988,GSE33316,GSE120006,GSE70769,MSKCC)中,表达C-MYC的前列腺癌有显著的共表达SOX4的特征(P=0.002),C-MYC和SOX4在高侵袭性前列腺癌中的表达均显著增高(P<0.05)、二者之间存在显著的相关性(P<0.001);2.2对IHC检测结果的统计分析表明,前列腺癌中C-MYC过表达与SOX4过表达显著相关(P=0.022);2.3 C-MYC和SOX4在LNCaP和VCaP这两种前列腺癌细胞系均有一定水平的表达;2.4 siRNA敲减SOX4后,C-MYC在两种前列腺癌细胞系内表达水平的改变不一,即C-MYC mRNA和蛋白在LNCaP细胞内表达增高,而在VCaP细胞内则表达减低;2.5 siRNA敲减C-MYC后,SOX4 mRNA和蛋白在两种前列腺癌细胞系内的表达一致性减低。而过表达C-MYC后,SOX4表达则一致性增高,与siRNA敲减实验结果一致。后续研究采取C-MYC转录调控SOX4的方向进行;2.6采用前列腺癌公共数据库(GSM1907205)预测C-MYC可结合到SOX4启动子区,采用在线工具预测C-MYC在SOX4基因上的结合位点;2.7选择5个潜在的结合位点进行ChIP实验,结果显示在SOX4基因TSS上游有抗C-MYC的有效免疫沉淀区域-1420bp～-1226bp;2.8双荧光素酶报告分析证实C-MYC可以直接结合到SOX4的启动子区。3.C-MYC和SOX4协同促进前列腺癌的进展3.1使用在线工具Citrome获得C-MYC和SOX4的共同靶基因,生物信息分析显示二者在靶基因的TSS区有最强的读取强度;3.2 Co-IP实验表明C-MYC和SOX4在蛋白水平上可相互作用,siRNA敲减实验表明SOX4对二者的结合必不可少;3.3 MTT、细胞克隆形成、划痕和Transwell等功能学实验表明,siRNA敲减C-MYC可显著地抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等能力,而再次表达SOX4则可使细胞功能显著恢复;3.4 siRNA敲减C-MYC可增强EMT中的上皮标记表达,抑制间质标记表达。而过表达SOX4则可部分逆转两种标记物的表达,表明C-MYC/SOX4轴可促进EMT发生。4.C-MYC+/SOX4+前列腺癌是一个预后不良的侵袭性亚型4.1对前列腺癌数据库(GSE35988,GSE70769,GSE74367)的分析表明,在去势抵抗性前列腺癌中,C-MYC+/SOX4+病例数显著高于局限型前列腺癌(P<0.05):4.2对公共数据库(GSE35988,GSE70769)中前列腺癌内的差异表达基因(DEG)进行分析,C-MYC+/SOX4+前列腺癌与去势抵抗性前列腺癌中的DEG相一致,主要富集在与细胞周期相关的基因上;4.3对IHC检测结果的统计分析显示,前列腺癌内C-MYC+/SOX4+与增殖指数Ki67之间存在显著的相关性(P<0.001);4.4在公共数据库和齐鲁医院的病例中,C-MYC+/SOX4+组前列腺癌的总生存率低。结论:1.C-MYC可能通过靶向激活SOX4促进前列腺癌进展;2.前列腺癌中C-MYC与SOX4可能协同促进前列腺癌进展;3.C-MYC/SOX4轴可能通过调控EMT机制促进前列腺癌进展;4.C-MYC/SOX4轴可能通过调控细胞周期促进前列腺癌进展;5.C-MYC+/SOX4+前列腺癌可能是一个预后不良的高侵袭性亚型。