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目的:瘙痒是一种不愉快的感觉,可诱发抓挠行为。急性痒作为一种预警信号可保护自身机体不受伤害,而慢性痒在临床上却给患者带来极大的痛苦。瘙痒的发生机制复杂多样,5-HT作为一种重要的瘙痒介质可通过相应5-HT受体参与痒觉调控,5-HT受体共有1 5种。有文章报道5-HT1F受体激活后会诱发抓挠行为,但是机制并不清楚,因此本文旨在阐明5-HT1F受体和瘙痒之间的联系。通过急性痒和慢性痒模型,采取一系列行为学、药理学和分子生物学手段,探究5-HT1F受体介导急慢性瘙痒的分子细胞机制,为临床上治疗慢性瘙痒提供新的靶点。方法:1.雄性ICR成年小鼠随机分组,每组6-8只,小鼠颈部剃毛后适应两天,然后皮内注射5-HT1F受体激动剂LY334370和LY334864,剂量(30 μg、50μg、100μg、200μg),行为学检测是否能够诱发抓挠行为。随后将小鼠分组,每组5-7只,建立脸颊模型,脸颊注射5-HT1F受体激动剂(100 μg、200 μg),运用行为学方法鉴定5-HT1F受体激活后是否能够诱发瘙痒反应。2.运用药理学手段,分组给小鼠注射Morphine(10 mg/kg)、Naloxone(10 mg/kg)、RTX、Compound48/80、Chloropheniramine(1 mg/kg)、TRPV4 拮抗剂(HC067047)、TRPV1 拮抗剂(Capsazepine)和 TRPA1 拮抗剂(HC030031)检测阿片受体、C纤维、肥大细胞、组胺受体和TRP家族是否参与5-HT1F受体激活后诱发的瘙痒,以此探究激活5-HT1F受体调控瘙痒的(?)制。3.采用TRPV1-/-、TRPA1-/-以及TRPV4-/-小鼠,在野生型和基因敲除小鼠颈部注射5-HT1F受体激动剂,检测基因敲除后对小鼠急性痒行为学的影响,确定5-HT1F诱发瘙痒和TRP家族的关系。4.ICR小鼠分组建立银屑病和干皮病两种慢性痒模型,连续造模七天后剥离DRG,应用荧光定量PCR技术(Q-PCR)检测5-HT受体亚型和TRP家族mRNA水平的基因表达变化情况,应用蛋白免疫印迹技术(Western blotting)检测5-HT受体亚型和TRP通道家族蛋白水平的变化情况。5.采用银屑病小鼠慢性痒模型,造模过程中第3天、第5天、第7天颈部皮内注射5-HT1F受体激动剂LY334370和TRPV4拮抗剂HC067047,观察药物处理后对小鼠慢性痒行为学的影响。6.采用FISH(荧光原位杂交)技术,检测5-HT1F在DRG和脊髓的分布情况以及5-HT1F和TRPV4在DRG的共定位情况。7.ICR小鼠颈部注射5-HT1F受体激动剂LY334370,10 min和30 min之后分离小鼠DRG和脊髓,通过Western blotting技术检测ERK的磷酸化情况;进一步利用药理学方法,在鞘内注射MEK的抑制剂U0126后观察小鼠急性痒行为的变化,探究5-HT1F介导的瘙痒行为和ERK磷酸化之间的关系。8.HEK293A细胞转染5-HT1F和TRPV4质粒,采用钙成像技术,检测给予5-HT1F激动剂LY334370后是否会引起胞内钙浓度的变化。结果:1.颈部皮内注射5-HT1F受体激动剂LY334370和LY334864后,呈剂量依赖性诱发小鼠抓挠行为。脸颊皮内注射上述两种激动剂后,主要诱发后爪抓挠行为而非前掌擦拭行为。上述实验结果显示激活5-HT1F受体可诱发瘙痒反应。2.药理学数据显示,阿片受体、C纤维、肥大细胞参与5-HT1F介导的瘙痒行为,而组胺受体拮抗剂能够抑制5-HT1F介导的瘙痒行为。3.TRPV1和TRPA1的拮抗剂以及TRPV1和TRPA1基因敲除后均不能降低这种瘙痒行为的产生,但是TRPV4的拮抗剂以及TRPV4基因敲除后可以抑制5-HT1F受体激活后诱发的搔抓行为。4.Q-PCR结果显示PSO(银屑病)和AEW(干皮病)这两种慢性痒模型小鼠DRG上5-HT1F和TRPV4基因表达水平升高;Western blotting结果显示这两慢性痒模型小鼠DRG上5-HT1F和TRPV4蛋白表达水平升高。5.在PSO小鼠造模过程中注射LY334370能够增加慢性痒行为次数,注射HC067047能够降低慢性痒行为次数。6.荧光原位杂交结果显示5-HT1 F受体和TRPV4在DRG共表达;5-HT1F主要分布在DRG中CGRP阳性神经元以及脊髓背角。7.Western blotting结果显示LY334370能够显著促进DRG和脊髓中ERK的磷酸化水平;鞘内注射MEK抑制剂U0126能够显著降低LY334370诱发的急性痒行为,表明p-ERK可能参与5-HT1F介导的瘙痒行为。8.钙成像实验结果显示HEK293A细胞转染5-HT1F质粒,给予LY334370后会引起胞内钙的增加。结论:1.激活5-HT1F能够诱发急性痒和慢性痒。2.5-HT1F通过激活TRPV4离子通道,引起ERK的磷酸化,继而诱发瘙痒。