LRSAM1（Human leucine rich repeat and sterile alpha motif containing1）是一种E3泛素连接酶，最近研究发现它的E3活性与体内的小泡运输，信号转导，细胞粘附和病原菌感染过程中的自噬降解等密切相关。LRSAM1分子属于典型的RING Finger型E3蛋白，它的C端有一个保守的RING锌指结构，同时它的N端包含一个六组重复序列的LRR结构域，它们分别与LRSAM1的活性和相互作用有关。　　泛素化修饰是一种广泛存在于真核生物体内的蛋白翻译后修饰，它是一个多酶级连反应，涉及到E1泛素活化酶，E2泛素结合酶和E3泛素连接酶，此过程还需要其它分子，如ATP，Mg2+等的参与。泛素化过程与机体的多种生理功能调控有关，如细胞的增殖分化，信号转导，蛋白定位，抗病毒，DNA损伤修复，自噬，生长发育，凋亡等。　　最近研究表明泛素化参与病原菌的自噬降解，并且LRSAM1是参与病原菌泛素化自噬降解的关键E3。但是关于LRSAM1的结构功能的生物化学特征的研究甚少。介于目前尚未有关于得到高活性的LRSAM1的纯化策略，所以我们首先对LRSAM1进行了原核的表达和纯化，优化了它的纯化条件，并对它的E3活性进行了分析，研究结果如下：　　原核表达系统中表达的LRSAM1蛋白，几乎完全以包涵体的形式表达，即使加入增溶性tag，如6*His，GST，Sumo，pelB，也不能增加其可溶性，所以对其进行了尿素变性复性纯化，复性后的蛋白能以可溶性的上清存在。但是对其进行亲和纯化时发现，复性后的蛋白可能是因为折叠错误或复杂的空间结构致使亲和tag，如GST，6*His不能与GST beads和NI-NTA beads结合，所以无法进行亲和纯化。同时在进行离子交换层系纯化时发现，无论在变性还是复性情况下，任何一个重组蛋白都不能经离子交换层析系统进行分离。这些问题的出现迫使我们必须寻找新的方法去得到可溶的和高纯度的LRSAM1蛋白。最后我们构建了no tag的LRSAM1，通过变性复性后进行硫酸铵沉淀分离，最后得到了高纯度的目的蛋白，用SDS-PAGE分析结果表明其纯度高达95％以上。　　体外重组E3 LRSAM1活性时，我们发现它的体外活性不稳定，为了得到更高更稳定的E3活性蛋白，我们比较了诱导温度、诱导浓度、培养菌株、纯化的缓冲液及其内成分、纯化缓冲液的pH等，最后我们发现不同pH值的缓冲液对LRSAM1活性有明显影响。　　作为典型的RING型E3蛋白，LRSAM1具有锌指模型，我们通过比对确定了它的活性位点，并对其中的两个活性位点（Cys675和His692）进行了定点突变，进一步证明了锌指结构对其E3活性的重要性，发现Cys675和His692是其活性的关键位点。　　LRSAM1具有自泛素化能力，研究表明不同泛素化链类型介导不同的功能，如单泛素化与蛋白定位，胞内调节有关，Lys48多泛素链介导靶向蛋白的降解。Lys63多泛素链与DNA损伤修复，应激反应，内吞作用等有关，所以在此我们研究了LRSAM1介导的自泛素化链型，结果证明LRSAM1自身能发生Lys6-，Lys27-。Lys29-和Lys48-连接的多泛素链。　　因为一种E3的活性可能有不同的E2去介导，所以我们研究了E2对LRSAM1自泛素化的影响。UbcH5b和UbcH5c作为LRSAM1自泛素化过程中的E2发生作用，我们对七种不同的人源E2进行纯化并与LRSAM1进行体外活性重组。结果表明因为UbcH5a与UbcH5b和UbcH5c结构上和功能上的相似性。UbcH5a也可以作为E2参与LRSAM1介导的泛素化过程中，而其它一些被检验的E2，如UbcH3b，UbcH6。UbcH7和UbcH10则不能介导此过程。　　泛素化是主要是泛素分子C端的甘氨酸（Gly）中的羧基与底物分子中的赖氨酸（Lys）残基中的ε氨基形成酰胺键，所以底物分子中的Lys是形成泛素链的关键。经过比对和实验发现LRSAM1分子中的Lys491位可能是主要的自泛素化位点。泛素链的形成和去除是一个不对等的可逆过程，泛素链的形成需要E1，E2和E3三种酶介导，泛素链的去除需要去泛素化酶（DUB）调控，SseL作为一种存在于沙门氏菌（Salmonella）中的去泛素化酶，我们的研究表明SseL能降解LRSAM1介导形成的泛素链。　　综上所述，LRSAM1作为一种人源E3，原核表达系统中主要以包涵体的形式存在，经变复性和硫酸铵沉淀处理我们获得了高纯度的LRSAM1；在优化其体外活性时发现LRSAM1活性对纯化缓冲液的pH值有一定依赖性；锌指结构中保守的半胱氨酸（Cys）和组氨酸（His）是其E3活性的关键位点；它介导的自泛素化链型主要是Lys6-，Lys27-，Lys29-，和Lys48-连接的多泛素化；作为一个家族，UbcH5a、UbcH5b和UbcH5c都是LRSAM1介导的泛素化过程中的E2，而其它一些E2则不能；通过对4个可能的自泛素化位点的突变分析，表明LRSAM1分子中的Lys491位是其主要的自泛素化位点；SseL作为一种沙门氏菌中的去泛素化酶能降解LRSAM1介导形成的泛素链。本研究以一种可靠高效的方法得到了高纯度和高活性的LRSAM1蛋白，为体外寻找与LRSAM1分子相互作用的蛋白提供了良好的基础，同时也针对E3特性对LRSAM1分子的生物化学特征做了大量研究。