前言　　肺炎支原体(MycoplasmaPneumoniae，Mp)是人类原发性非典型肺炎的病原体，其感染的临床合并症复杂，因此，准确的临床诊断有非常重要的意义。应用重组蛋白抗原检测临床标本，有较高的特异性和敏感性，国内外已有人成功构建了MpP1蛋白的表达载体。CARDS毒素蛋白是近年来确定的Mp毒力因子蛋白，在难治性哮喘患者的临床标本检测中，其检测率高于P1蛋白[1]。但该重组蛋白作为诊断试剂在肺炎支原体呼吸道感染患者中的检出率如何，尚未见报道。本研究拟构建CARDS毒素重组蛋白表达载体，用纯化的CARDS毒素重组蛋白检测临床标本，并与已构建的P1重组蛋白检测结果进行比较，以期探讨肺炎支原体CARDS毒素重组蛋白抗原作为诊断试剂在临床诊断方面的应用价值。　　方法　　1、CARDS毒素蛋白目的基因的筛选　　应用NCBI在线分析软件TMHMM，从GenBank提供的CARDS毒素蛋白MPN433基因(CP002077.1)序列中筛选CARDS毒素蛋白的跨膜基因，抗原决定簇分析工具进行抗原表位预测，蛋白同源性BLAST软件对筛选基因与人和其它生物的基因库进行Blast对比分析，选择抗原表位多、特异性强的区域作为预选的目的基因。　　2、MpDNA制备及PCR扩增目的基因片段　　Mp培养及其DNA提取纯化按照本实验室常规方法进行。根据GenBank提供的CARDS毒素蛋白的基因序列，筛选目的基因序列，通过引物分析软件Primer5.0设计引物。　　上游引物序列:5-AAAATGCCAAATCCTGTTAG-3(BamHⅠ)，下游引物序列:3-CAAGCACTACGGACATTAGC-5(EcoRⅠ)。PCR反应条件为:94℃5min×1;94℃30s，61.8℃30s，72℃30s×30;72℃7min×1，反应总体积为20μl。对PCR结果进行2.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。　　3、CARDS毒素蛋白克隆载体PMD-19T的构建与鉴定　　将回收的CARDS毒素蛋白目的片段与PMD-19T载体连接，转入E.coliBL21菌株中。通过氨苄青霉素平板筛选阳性克隆株。提取阳性克隆株的重组质粒，用CARDS毒素蛋白的特异引物PCR扩增目的基因。目的基因测序由北京六合华大科技股份有限公司完成，并与GenBank提供MpFH株肺炎支原体MPN433核苷酸(CP002077.1)序列进行同源性比较。　　4、CARDS毒素蛋白表达载体的构建与鉴定　　(1)表达载体的构建　　从克隆菌株中提取纯化重组质粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，然后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段，与BamHⅠ和EcoRⅠ酶切的pGEX-6p-1表达载体连接，转入E.coliBL21菌株中。氨苄青霉素平板筛选转化子，提取纯化的重组质粒分别用质粒酶切图谱和PCR扩增鉴定。　　(2)目的基因表达产物的检测与鉴定　　筛选的克隆株接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，加入IPTG，37℃诱导表达，离心收集菌体沉淀，超声裂解菌体，用GlutathioneSepharose4B纯化GST-CARDS融合蛋白，并进行蛋白定量。用SDS-PAGE电泳分析表达产物的相对分子量，WesternBlot实验鉴定其免疫反应性。　　5、P1重组蛋白的提取和纯化　　表达P1重组蛋白的克隆株，已由本教研室构建。P1重组蛋白的提取、纯化和定量定性方法同上。　　6、以CARDS毒素重组蛋白和P1重组蛋白为抗原建立ELISA反应检测患者血清　　(1)抗原最佳工作浓度的确定　　以重组蛋白做抗原，方阵滴定法确定CARDS和P1两种重组蛋白作为抗原的最佳工作浓度，按照确定的抗原最佳工作浓度包被酶标板，建立两种重组蛋白为抗原的间接ELISA检测临床标本的方法。　　(2)阳性结果判定　　用重组CARDS毒素蛋白和P1蛋白分别作为包被抗原，采用P/N比率法对结果进行判定。　　(3)临床标本的检测　　用两种重组蛋白抗原包被酶标板，间接ELISA法检测临床血清标本（正常献血者血清37份，临床疑似Mp感染血清85份）中的MpIgG抗体。配对卡方检验比较重组蛋白检测的敏感性。　　结果　　1、CARDS毒素蛋白目的基因的筛选　　根据抗原表位分析软件预测分析，CARDS毒素蛋白有27个抗原表位区，考虑到Mp基因存在非通用密码子，我们选择了CARDS毒素蛋白N端含有5个预测抗原表位的426bp大小的基因序列作为预选靶序列。　　2、CARDS毒素蛋白目的基因片段的扩增与鉴定　　PCR扩增目的片段大小为426bp，经2.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增产物与理论值大小基本相符。　　3、PMD-19T-CARDS克隆载体的构建与鉴定　　从筛选的阳性克隆株提取质粒DNA做模板，PCR扩增出一条大小为426bp的带。经测序鉴定，插入基因片段与已知的CARDS毒素蛋白核苷酸序列完全一致。　　4、pGEX-6p-1-CARDS表达载体的构建与鉴定　　以重组的pGEX-6p-1-CARDS质粒为模板。PCR扩增获得单一条带，用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，产生426bp和4.9kb大小的两条带。经酶切鉴定，结果与预期一致。　　5、pGEX-6p-1-CARDS基因表达产物的鉴定　　SDS-PAGE电泳结果显示，pGEX-6p-1-CARDS重组株，表达相对分子量(Mr)为43kD的融合蛋白，与预期大小一致。　　Westernblot结果显示，兔抗Mp多价血清与纯化的GST-CARDS融合蛋白在43kD处形成了一条特异的抗原-抗体反应条带。说明该重组蛋白含有CARDS毒素蛋白的特异性抗原决定簇，可被兔抗Mp多价抗体识别。　　6、以CARDS毒素重组蛋白和P1重组蛋白为抗原建立ELISA反应检测患者血清　　方阵滴定法确定抗原的最佳包被浓度，CARDS毒素蛋白为3.6μg/ml，P1重组蛋白为4μg/ml。比率法确定检测的37份健康人血清的平均校正值，CARDS毒素蛋白为0.4806，P1重组蛋白为0.4330。以此为标准，判定阳性。检测85份临床Mp疑似感染血清标本，CARDS毒素重组蛋白抗原检测的阳性率为70.59％，P1重组蛋白抗原检测阳性率为63.53％。由此得出，CARDS毒素重组蛋白抗原的敏感性高于P1重组蛋白抗原。　　结论　　1、成功构建了pGEX-6p-1-CARDS表达载体。　　2、用CARDS毒素重组蛋白抗原检测临床标本，其敏感性高于P1重组蛋白抗原，可为临床Mp感染的辅助诊断提供新的依据。